本文選題：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎　切入點：滑膜成纖維樣細胞　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)最主要的病理改變是滑膜炎,以滑膜細胞凋亡減少、腫瘤樣生長及炎性介質(zhì)大量分泌為特征,繼而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞及骨侵蝕,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)的不可逆破壞從而致殘。成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)是關(guān)節(jié)滑膜的重要組成部分,是上述病理過程的重要參與者。RA-FLS的激活與多條信號通路有關(guān),其中最為經(jīng)典的信號通路便是NF-κB信號通路。在RA-FLS中,NF-κB通路被明顯激活后其下游靶基因(如cIAP1、cIAP2、IL-1,IL-6)的表達增加使得RA-FLS抗凋亡能力以及炎癥因子、粘附分子、基質(zhì)降解酶的分泌能力明顯升高。除了NF-κB信號通路外,Wnt信號通路在RA中的作用也是近年來研究的熱點,有證據(jù)顯示W(wǎng)nt信號通路在RA中也處于激活狀態(tài),參與了RA-FLS的活化。巢亂蛋白(Dishevelled,Dvl)是處在Wnt信號通路中游的關(guān)鍵的信號蛋白分子,是非常重要而有趣的分子。Dvl有三種的同型異構(gòu)體(Dvl1,DVL2,Dvl3)和4個高度保守結(jié)構(gòu)域(DIX域、PDZ域、DEP域以及DSV)。Dvl不僅是經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt通路的分線器,也可以與其他信號通路上的幾十種蛋白相互作用,所以也是Wnt通路與BMP、mTOR等多條信號通路的交匯點。盡管在腫瘤中已經(jīng)有一些關(guān)于Dvl蛋白的研究,但是目前在RA中還沒有關(guān)于Dvl蛋白表達及功能的相關(guān)研究。因此,本研究著重探討了DVL2在RA滑膜組織和RA-FLS中的表達情況以及其對RA-FLS凋亡和炎癥因子分泌的影響和相關(guān)分子機制。一、DVL2在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織及RA-FLS中處于高表達狀態(tài)首先,我們與關(guān)節(jié)外科合作,獲取了RA、骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)及正常創(chuàng)傷(Trauma)患者的滑膜組織,通過免疫組織化學(xué)(IHC)、蛋白質(zhì)印記(WB)等方法檢測了DVL2蛋白的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)盡管DVL2蛋白的表達在RA與OA中沒有顯著差異,但是RA滑膜組織中的DVL2蛋白表達量明顯高于Trauma患者,提示DVL2可能通過Wnt通路參與RA滑膜的增殖。另外,從滑膜組織中提取原代FLS后進行檢測,結(jié)果同樣顯示DVL2在RA-FLS中的表達高于Trauma-FLS。滑膜組織的IHC和RA-FLS的免疫熒光檢測結(jié)果顯示DVL2在FLS的細胞質(zhì)和細胞核中均有表達。二、DVL2在體內(nèi)可促進RA-FLS凋亡并抑制其炎癥因子的分泌在明確了DVL2在RA滑膜組織和RA-FLS中呈高表達狀態(tài)后,為了對其功能做進一步的研究,我們建立了膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠(CIA)模型,并構(gòu)建了人源DVL2慢病毒過表達質(zhì)粒(lv-dvl2),包裝成慢病毒后注入cia大鼠膝關(guān)節(jié)中。待dvl2過表達后觀察大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜、軟骨、及軟骨下骨的變化,并對關(guān)節(jié)滑膜細胞凋亡及炎癥因子分泌情況進行檢測。有趣的是,dvl2在cia大鼠膝關(guān)節(jié)中過表達后非但沒有使滑膜增殖進一步加重,反而一定程度上抑制了滑膜炎并對關(guān)節(jié)起到了一定的保護作用。對大鼠的關(guān)節(jié)滑膜和全膝關(guān)節(jié)進行病理檢查發(fā)現(xiàn)dvl2可以減輕cia大鼠滑膜炎;通過對大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)的關(guān)節(jié)液進行elisa檢測發(fā)現(xiàn)dvl2可減少cia大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)il-1β、il-6及il-8的分泌;micro-ct檢測結(jié)果顯示dvl2可以減輕cia大鼠軟骨下骨的破壞;但是番紅o-固綠染色并未觀察到dvl2可以明顯減輕cia大鼠關(guān)節(jié)軟骨破壞。進一步的tunel檢測結(jié)果顯示dvl2可以明顯增加cia大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜的凋亡,提示dvl2除了可能參與ra滑膜的增殖以外,還可以在體內(nèi)調(diào)控滑膜細胞的凋亡。三、dvl2在體外也可促進ra-fls凋亡并抑制其炎癥因子的分泌為了進一步研究dvl2在ra中的功能及可能的作用機制,我們提取了人源的ra-fls細胞并在其中過表達了dvl2基因,然后進行高通量mrna測序,結(jié)果發(fā)現(xiàn)nf-κb通路及tnf通路都出現(xiàn)了明顯的下調(diào)。因此,我們將dvl2在ra-fls中過表達后觀察其對ra-fls細胞活性、凋亡、周期以及炎癥因子分泌的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在體外過表達dvl2的ra-fls細胞活性明顯下降,在加入tnf-α刺激后這一現(xiàn)象更為明顯;進一步對ra-fls的凋亡及細胞周期進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)dvl2可以明顯增加ra-fls凋亡率并對細胞周期造成一定的影響;用elisa方法對細胞上清進行檢測發(fā)現(xiàn),dvl2可減少ra-fls分泌的il-1β、il-6及il-8;而這一抑制作用也在加入tnf-α刺激后同樣變得更為明顯。提示dvl2在炎性環(huán)境下可以抵消一部分炎癥反應(yīng),從而一定程度上遏制ra-fls的無限增殖。四、dvl2通過抑制nf-κb通路影響ra-fls凋亡和炎癥因子的分泌結(jié)合上述結(jié)果,我們推測dvl2可以抑制ra-fls的增殖及炎癥因子的分泌很有可能是通過抑制nf-κb通路進而抑制其調(diào)控基因?qū)崿F(xiàn)的。因此,我們首先通過rt-pcr對mrna測序所得的差異基因進行驗證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)dvl2在ra-fls中過表達后可以抑制抗凋亡基因a20、gadd45β、和ciap2的表達,而對ciap1的表達卻沒有明顯的影響;當(dāng)給予tnf-α刺激后再次對其進行了檢測,rt-pcr結(jié)果顯示DVL2對A20、cIAP1和cIAP2的表達起到顯著的抑制作用,但對GADD45β的表達卻沒有明顯的影響;DVL2在RA-FLS細胞中過表達后IL-6基因表達明顯下調(diào),而IL-1β及IL-8的基因表達卻沒有明顯變化;給予TNF-α刺激后DVL2則可明顯抑制RA-FLS中IL-1β、IL-6以及IL-8基因的表達。因為上述抗凋亡基因和炎癥因子基因均可被NF-κB通路調(diào)控,所以我們推斷DVL2是通過抑制NF-κB通路實現(xiàn)上述功能的。那么DVL2是如何抑制NF-κB通路的呢?首先我們通過Flowsight檢測發(fā)現(xiàn)DVL2在RA-FLS中可以抑制P65的入核;通過IP檢測發(fā)現(xiàn)DVL2在RA-FLS中也可以與P65相互作用,通過ChIP檢測發(fā)現(xiàn)DVL2與P65相互作用后可以抑制P65與上述靶基因啟動子的結(jié)合,從而減少抗凋亡基因和炎癥因子基因的表達。綜上所述,本研究從臨床滑膜標本的采集到原代細胞的培養(yǎng),從體內(nèi)動物實驗到體外細胞實驗再到基因?qū)哟蔚母脑?全面系統(tǒng)的研究了DVL2在RA患者關(guān)節(jié)滑膜原代細胞中的表達情況以及DVL2在體內(nèi)體外對RA-FLS增殖及炎癥因子分泌的影響。除了觀察現(xiàn)象我們還利用m RNA-seq、IP、Flowsight、ChIP等方法對DVL2的作用機制進行了深入研究。發(fā)現(xiàn)雖然DVL2在RA滑膜中處于高表達狀態(tài),可能參與了滑膜的腫瘤樣生長,但是DVL2也可以促進RA-FLS凋亡并抑制其炎癥因子的分泌。而DVL2之所以能發(fā)揮這種雙刃劍樣的作用,主要是其一方面是Wnt信號通路中重要的正向調(diào)控蛋白,另一方面DVL2還可以通過影響P65的入核及其與下游調(diào)控基因啟動子的結(jié)合來抑制NF-κB通路。DVL2多重功能的發(fā)現(xiàn)對于理解Wnt和NF-κB通路這兩條重要的信號通路在RA中的功能對話提供了重要信息,同時也為理解RA的發(fā)生發(fā)展以及尋找新的治療靶點提供了思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R593.22

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本文編號：1596387