發(fā)布時間：2018-03-10 19:29

  本文選題：淀粉樣變性　切入點：剛果紅染色　出處：《天津醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的家族性淀粉樣多發(fā)性神經損害(Familial amyloid polyneuropathy,FAP)是一種常染色體顯性遺傳性疾病,是由基因突變型轉甲狀腺素(Transthyretin,TTR)形成淀粉樣變纖維沉積在細胞外所致。TTR主要由肝臟和脈絡叢分泌,生理條件下以同源四聚體形式存在于血液以及腦脊液。研究報道FAP患者淀粉樣沉積陽性組織內存在過氧化修飾產物,包括脂肪過氧化標記產物TEBRS、蛋白過氧化標記產物Carbonyl。此外TTR的S-亞硝基化能夠引起其分子立體結構改變,在酸性條件下促進淀粉樣變纖維形成。因此,氧化代謝修飾可能參與TTR淀粉樣變纖維形成。本研究旨在研究FAP患者TTR蛋白酪氨酸硝基化修飾與淀粉樣變纖維形成之間的關系,為解析FAP患者淀粉樣變形成的分子機制奠定基礎。方法1.選取FAP患者5例(男性3例,女性2例,年齡58-68歲),提取外周血細胞DNA,設計TTR基因4個外顯子擴增引物,進行PCR體外擴增,之后將擴增產物進行DNA測序,分析FAP患者TTR基因突變類型。2.收集患者尸體解剖的心臟,腎臟以及腦組織,進行石蠟包埋,制備病理組織切片。將組織切片進行剛果紅(Congo red,CR)染色結合偏振光顯微鏡觀察,確定FAP患者組織中存在淀粉樣變沉積。利用抗TTR特異性抗體免疫組織化學染色,鑒定淀粉樣蛋白類型。3.對剛果紅染色陽性的組織進行MPO免疫組織化學染色,檢測淀粉樣變沉積部位MPO表達。4.在FAP患者心肌組織切片上加入反應混合液(10m M PBS,pH7.4,含有100μM DTPA,100μM H2O2,10μM Na NO2和10μM N-acetyl-tyrosine),37℃下孵育12h,之后用抗3-硝基酪氨酸抗體進行免疫組織化學染色。5.對選取的FAP患者血清總蛋白進行定量TP在65.2-83.5g/L之間。每個研究對象分別取兩份等量蛋白(200μg)血清,一份加入反應混合液(10m M PBS,p H7.4,含有100μM DTPA,150 m IU MPO,100μM H2O2,10μM Na NO2),另一份為對照組,37℃下孵育2h。6.將MPO/H2O2/NO2-反應體系作用于血清后進行雙向電泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE)以及抗-TTR抗體免疫印跡(Western Blot)實驗,對比該硝基化系統(tǒng)作用前后TTR的表達。結果1.利用PCR體外擴增技術以及結合DNA測序分析技術,分析FAP患者TTR基因型,確定FAP患者TTR基因突變型為TTR V30M。2.通過CR結合偏振光顯微鏡觀察發(fā)現,FAP患者心臟,腎臟等組織中存在淀粉樣變沉積,利用抗TTR免疫組織化學染色,確定淀粉樣變蛋白類型為TTR蛋白。3.FAP患者心臟與腦組織的血管壁中存在淀粉樣變沉積,其淀粉樣變沉積成分主要累及血管的內膜和外膜。4.對FAP患者心臟、腎臟以及動脈血管組織進行抗MPO抗體免疫組織化學染色,其免疫反應陽性與淀粉樣變沉積共存,提示患者組織內淀粉樣變沉積成分中存在MPO成分。5.MPO/H2O2/NO2-反應系統(tǒng)與FAP患者淀粉樣變沉積共同孵育,結果顯示抗3-硝基酪氨酸抗體免疫反應與淀粉樣沉積共存,提示淀粉樣變蛋白成分能夠發(fā)生硝基化。6.利用2-DE電泳以及抗3-硝基酪氨酸抗體Western Blot實驗結果顯示,在MPO/H2O2/NO2-系統(tǒng)作用下,FAP患者血清TTR的等電點發(fā)生改變以及表現出蛋白聚合。結論1.系統(tǒng)分析了FAP患者組織淀粉樣變沉積分布特征,發(fā)現FAP患者血管淀粉樣變沉積主要累積在血管壁內膜和外膜。填補了FAP淀粉樣變沉積可累及的組織器官信息。2.首次報道FAP患者的淀粉樣變沉積組織中存在MPO成分,且MPO/H2O2/NO2-反應體系能夠介導FAP患者組織淀粉樣變沉積處蛋白成分發(fā)生硝基化修飾。3.FAP患者血清TTR蛋白經過MPO/H2O2/NO2-體系作用,發(fā)生硝基化代謝修飾,并且TTR分子聚合具有明顯增加趨勢�？偨Y研究結果提示FAP患者中TTR蛋白酪氨酸硝基化可能促進TTR聚合,進而有利于淀粉樣變沉積形成。
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【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R596

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 舒燕;姜榮建;程標;孔洪;賴金川;王正陽;;心臟淀粉樣變的心臟超聲及心電圖特點[J];心血管康復醫(yī)學雜志;2013年01期

2 王蓉;;前白蛋白是營養(yǎng)狀況監(jiān)測的最好指標[J];國際護理學雜志;2006年12期

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本文編號：1594749