本文選題：BIV　切入點：Vif　出處：《吉林大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：引發(fā)宿主重大疾病的許多病原體，包括HIV病毒在內(nèi)，在長期進化過程中衍生出一系列拮抗宿主細胞內(nèi)抗病毒因子的輔助感染蛋白，從而完成病毒在宿主體內(nèi)的高效復(fù)制。另一方面，在HIV-1感染人類細胞過程中，宿主自身產(chǎn)生一類通過不同途徑發(fā)揮抗病毒功能的蛋白，這類蛋白稱為宿主限制因子。病毒輔助蛋白與宿主限制因子之間的相互作用機制研究是獲得性免疫缺陷綜合癥研究領(lǐng)域的熱點問題�，F(xiàn)階段已經(jīng)被闡明的病毒輔助蛋白與宿主限制因子的作用機制包括：1.HIV-1的病毒感染因子Vif和宿主限制因子APOBEC3G；2.HIV-1的衣殼蛋白(capsid)與宿主限制因子TRIM5α；3.HIV-1的功能蛋白Vpu與宿主限制因子Tetherin(BST-2)；4.HIV-2附屬蛋白Vpx與宿主限制因子SAMHD1。病毒輔助蛋白和宿主限制因子之間的相互作用存在種屬特異性，主要表現(xiàn)為病毒輔助蛋白的跨種屬活性以及宿主限制因子的廣譜抗病毒活性。一方面，某些不能感染人類的病原體在長期進化過程中，產(chǎn)生能有效拮抗人類宿主限制因子的輔助蛋白，使病毒感染的種屬范圍擴大，從而產(chǎn)生了近些年來大量爆發(fā)的人畜共患病。因此對于其他種屬的宿主限制因子與病毒蛋白的相互作用機制的研究可為防治人畜共患病研究領(lǐng)域提供理論依據(jù)。另一方面，病毒感染宿主范圍的限制，導(dǎo)致藥物開發(fā)中動物模型選擇的局限性。HIV-1在非人類細胞中的感染力會被其他種屬細胞內(nèi)的同源宿主限制因子大大削弱，致使HIV-1病毒不能感染其他種屬，比如非人靈長類動物。從而衍生出針對HIV-1病毒改造，使其能夠在猴體內(nèi)長期復(fù)制的研究領(lǐng)域。在本論文中，我們以宿主限制因子與病毒輔助蛋白的相互作用機制為出發(fā)點，圍繞上述兩方面內(nèi)容進行討論。 本論文的第一部分是圍繞宿主限制因子APOBEC3蛋白在其他種屬中與其對應(yīng)的慢病毒Vif蛋白的作用機制展開研究。 慢病毒（lentiviruses）是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一個亞家族，由于這種病毒在宿主體內(nèi)會產(chǎn)生一個長的疾病潛伏期而得名。其中研究最多的是人類免疫缺陷病毒HumanImmunodeficiency Virus, HIV）和猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV），另外還有貓免疫缺陷病毒（Feline Immunodefiency Virus, FIV）以及一些感染偶蹄類動物的病毒包括牛免疫缺陷病毒（Bovineimmunodeficiencyvirus,BIV），綿羊梅迪-維斯那病毒（Maedi-visnavirus，MVV）以及馬傳染性貧血病毒（equineinfectious anemiavirus，EIAV)等。對于除EIAV之外的慢病毒，Vif蛋白都是與病毒感染、復(fù)制相關(guān)的重要輔助因子。其中HIV, SIV, FIV的Vif蛋白對相應(yīng)宿主限制因子A3s蛋白的降解作用機制已經(jīng)被廣泛的研究，Vif蛋白通過招募ElonginB，ElonginC，Cullin5形成E3泛素連接酶復(fù)合物降解相應(yīng)宿主的APOBEC3蛋白。但是BIV以及MVV的Vif對相應(yīng)的宿主A3s蛋白的降解作用機制尚未被揭示。本論文對BIV以及MVV Vif介導(dǎo)的相應(yīng)宿主APOBEC3蛋白的降解機制進行了研究。研究發(fā)現(xiàn)BIV以及MVV Vif介導(dǎo)的降解機制與已被闡述的HIV-1, SIV以及FIV Vif介導(dǎo)的降解機制既存在共同性又存在一定的不同之處：BIV以及MVV Vif同樣是通過蛋白酶體途徑降解宿主A3蛋白；BIV以及MVVVif中都存在對降解作用至關(guān)重要的與ElonginC結(jié)合的BC-Box。但它們所招募的E3連接酶復(fù)合物成員不完全相同：BIV Vif降解復(fù)合物成員包括ElonginB, ElonginC以及Cullin2，MVV Vif降解復(fù)合物成員包括ElonginB, ElonginC以及Cullin5，BIV以及MVV Vif介導(dǎo)的降解均不依賴CBF-β；與其他慢病毒的Vif蛋白在形成E3復(fù)合物中對Cullin蛋白的選擇性不同， BIV Vif是唯一一個招募Cullin2蛋白的。鋅離子螯合劑TPEN能夠阻斷BIV Vif對APOBEC3蛋白的降解，說明Zn2+對BIV Vif的活性有重要意義。通過序列比對以及點突變的方法我們證實了BIV Vif上與btCullin2之間相互作用的關(guān)鍵位點為C-x1-C-x1-H-x19-C基序。鋅親和層析實驗表明BIV Vif與Zn2+間的相互結(jié)合依賴于C-x1-C-x1-H-x19-C基序，它是與以往報道的Zn指結(jié)構(gòu)都不盡相同的一個全新的Zn2+結(jié)合環(huán)。MVVVif雖與Cullin5相結(jié)合，但在MVVVif上未發(fā)現(xiàn)Cul5-box或HCCH基序，并且MVV Vif對宿主APOBEC3蛋白的降解幾乎不受TPEN的影響，說明MVV Vif介導(dǎo)的降解不依賴Zn2+的參與，這些都暗示MVV Vif與oaCul5之間的相互作用方式不同于HIV-1或SIV Vif。 本論文的第二部分內(nèi)容是利用宿主限制因子的種屬特異性，對病毒進行改造，試圖突破種屬間傳播的限制瓶頸。1981年艾滋病發(fā)現(xiàn)至今短短30余年時間里，全球已有超過3400萬人感染艾滋病。然而沒有合適的動物模型是阻礙艾滋病藥物與疫苗開發(fā)的關(guān)鍵因素之一�，F(xiàn)階段用于研究艾滋病的動物模型有兩種：一種是HIV-1感染黑猩猩和SCID/hu鼠，但是它們的有效性和疾病特征嚴重限制了其應(yīng)用。另一種是用猴免疫缺陷病毒SIV或經(jīng)改造的SHIV感染恒河猴，盡管這種動物模型對于研究發(fā)病機理很有效，但由于SIV與HIV之間的差異，致使這種感染不能完全模擬HIV對人類的感染。因此該動物模型對于艾滋病治療藥物以及疫苗的評價存在一定的缺陷。那么，構(gòu)建更加完善的用于評價艾滋病疫苗或藥物的動物模型將有助于推動全球艾滋病的治療。 猴分為兩大種類：一種是新世界猴，如松鼠猴和通常的絨猴；另外一種是舊世界猴，如非洲綠猴（African green monkey, agm）和恒河猴（Rhesus Macacus, mac）。HIV在感染新世界猴的侵入階段就被阻斷，原因是病毒包膜蛋白gp120與細胞表面受體蛋白CD4和CCR5之間不能有效的相互作用。雖然HIV能有效的侵入舊世界猴，但在侵入后階段受到宿主細胞限制因子的制約，導(dǎo)致病毒不能有效復(fù)制。三種宿主限制因子解釋了侵入后阻斷：三維基體蛋白5α（TRIM5α）和脂蛋白APOBEC3家族以及膜蛋白BST2。在本論文中，我們通過對HIV-1的NL43病毒株骨架進行基因替換來解除HIV-1感染舊世界猴的限制因素。人源的TRIM5α，APOBEC3以及BST-2能夠分別被HIV-1的CA， Vif以及Vpu所拮抗，但恒河猴的同源宿主限制因子不能被HIV-1的CA,Vif以及Vpu拮抗，而是能夠被SIVmac239的CA, Vif以及HIV-1稀有亞型DH12的Vpu所拮抗。我們將HIV-1的CA，，Vif以及Vpu的穿膜區(qū)基因分別替換成SIVmac239的CA，Vif以及HIV-1DH12的Vpu穿膜區(qū)，獲得了stHIV-1嵌合病毒質(zhì)粒。我們在293T細胞中檢測到嵌合病毒stHIV-1的結(jié)構(gòu)蛋白的正常表達，并且能夠成功包裝出病毒顆粒。在此基礎(chǔ)上，我們通過MAGI-CCR5細胞檢測了包裝出的病毒顆粒對人類細胞的感染能力，發(fā)現(xiàn)嵌合病毒能夠成功感染人類MAGI細胞。替換部分的蛋白功能的驗證結(jié)果表明：stHIV-1的Vif能夠有效降解恒河猴的A3G蛋白，并且替換的Vpu能夠拮抗Rh BST-2對病毒出毒的抑制。在檢測stHIV-1的CA功能實驗中，我們沒能成功構(gòu)建穩(wěn)定表達恒河猴TRIM5α的人類T淋巴細胞系CEM×174，因此對于CA的功能驗證需要在今后的stHIV-1感染恒河猴PBMC實驗中進行間接驗證。此外，我們還成功的檢測到stHIV-1在CEM×174細胞系中的長期復(fù)制。在下一步計劃中，我們需要完成在Rh PBMC細胞中檢測stHIV-1的長期復(fù)制曲線，在此基礎(chǔ)上對恒河猴進行病毒功毒以及病毒傳代實驗，我們希望改造的病毒能夠在恒河猴體內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制并且最終能導(dǎo)致恒河猴的致病。 本論文的研究補充了BIV Vif-btA3Z2-Z3以及MVV Vif-oaA3Z2-Z3蛋白之間相互拮抗作用的機制，為病毒在牛羊中的疾病進程以及潛在的種屬間感染提供可參考的意義。另外stHIV-1的構(gòu)建有望成為更加理想的AIDS動物模型，推動AIDS治療藥物及疫苗的發(fā)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R512.91

【共引文獻】

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本文編號：1587985