本文選題：BIV　切入點(diǎn)：Vif　出處：《吉林大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：引發(fā)宿主重大疾病的許多病原體，包括HIV病毒在內(nèi)，在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中衍生出一系列拮抗宿主細(xì)胞內(nèi)抗病毒因子的輔助感染蛋白，從而完成病毒在宿主體內(nèi)的高效復(fù)制。另一方面，在HIV-1感染人類細(xì)胞過(guò)程中，宿主自身產(chǎn)生一類通過(guò)不同途徑發(fā)揮抗病毒功能的蛋白，這類蛋白稱為宿主限制因子。病毒輔助蛋白與宿主限制因子之間的相互作用機(jī)制研究是獲得性免疫缺陷綜合癥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。現(xiàn)階段已經(jīng)被闡明的病毒輔助蛋白與宿主限制因子的作用機(jī)制包括：1.HIV-1的病毒感染因子Vif和宿主限制因子APOBEC3G；2.HIV-1的衣殼蛋白(capsid)與宿主限制因子TRIM5α；3.HIV-1的功能蛋白Vpu與宿主限制因子Tetherin(BST-2)；4.HIV-2附屬蛋白Vpx與宿主限制因子SAMHD1。病毒輔助蛋白和宿主限制因子之間的相互作用存在種屬特異性，主要表現(xiàn)為病毒輔助蛋白的跨種屬活性以及宿主限制因子的廣譜抗病毒活性。一方面，某些不能感染人類的病原體在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，產(chǎn)生能有效拮抗人類宿主限制因子的輔助蛋白，使病毒感染的種屬范圍擴(kuò)大，從而產(chǎn)生了近些年來(lái)大量爆發(fā)的人畜共患病。因此對(duì)于其他種屬的宿主限制因子與病毒蛋白的相互作用機(jī)制的研究可為防治人畜共患病研究領(lǐng)域提供理論依據(jù)。另一方面，病毒感染宿主范圍的限制，導(dǎo)致藥物開(kāi)發(fā)中動(dòng)物模型選擇的局限性。HIV-1在非人類細(xì)胞中的感染力會(huì)被其他種屬細(xì)胞內(nèi)的同源宿主限制因子大大削弱，致使HIV-1病毒不能感染其他種屬，比如非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物。從而衍生出針對(duì)HIV-1病毒改造，使其能夠在猴體內(nèi)長(zhǎng)期復(fù)制的研究領(lǐng)域。在本論文中，我們以宿主限制因子與病毒輔助蛋白的相互作用機(jī)制為出發(fā)點(diǎn)，圍繞上述兩方面內(nèi)容進(jìn)行討論。 本論文的第一部分是圍繞宿主限制因子APOBEC3蛋白在其他種屬中與其對(duì)應(yīng)的慢病毒Vif蛋白的作用機(jī)制展開(kāi)研究。 慢病毒（lentiviruses）是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一個(gè)亞家族，由于這種病毒在宿主體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一個(gè)長(zhǎng)的疾病潛伏期而得名。其中研究最多的是人類免疫缺陷病毒HumanImmunodeficiency Virus, HIV）和猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV），另外還有貓免疫缺陷病毒（Feline Immunodefiency Virus, FIV）以及一些感染偶蹄類動(dòng)物的病毒包括牛免疫缺陷病毒（Bovineimmunodeficiencyvirus,BIV），綿羊梅迪-維斯那病毒（Maedi-visnavirus，MVV）以及馬傳染性貧血病毒（equineinfectious anemiavirus，EIAV)等。對(duì)于除EIAV之外的慢病毒，Vif蛋白都是與病毒感染、復(fù)制相關(guān)的重要輔助因子。其中HIV, SIV, FIV的Vif蛋白對(duì)相應(yīng)宿主限制因子A3s蛋白的降解作用機(jī)制已經(jīng)被廣泛的研究，Vif蛋白通過(guò)招募ElonginB，ElonginC，Cullin5形成E3泛素連接酶復(fù)合物降解相應(yīng)宿主的APOBEC3蛋白。但是BIV以及MVV的Vif對(duì)相應(yīng)的宿主A3s蛋白的降解作用機(jī)制尚未被揭示。本論文對(duì)BIV以及MVV Vif介導(dǎo)的相應(yīng)宿主APOBEC3蛋白的降解機(jī)制進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)BIV以及MVV Vif介導(dǎo)的降解機(jī)制與已被闡述的HIV-1, SIV以及FIV Vif介導(dǎo)的降解機(jī)制既存在共同性又存在一定的不同之處：BIV以及MVV Vif同樣是通過(guò)蛋白酶體途徑降解宿主A3蛋白；BIV以及MVVVif中都存在對(duì)降解作用至關(guān)重要的與ElonginC結(jié)合的BC-Box。但它們所招募的E3連接酶復(fù)合物成員不完全相同：BIV Vif降解復(fù)合物成員包括ElonginB, ElonginC以及Cullin2，MVV Vif降解復(fù)合物成員包括ElonginB, ElonginC以及Cullin5，BIV以及MVV Vif介導(dǎo)的降解均不依賴CBF-β；與其他慢病毒的Vif蛋白在形成E3復(fù)合物中對(duì)Cullin蛋白的選擇性不同， BIV Vif是唯一一個(gè)招募Cullin2蛋白的。鋅離子螯合劑TPEN能夠阻斷BIV Vif對(duì)APOBEC3蛋白的降解，說(shuō)明Zn2+對(duì)BIV Vif的活性有重要意義。通過(guò)序列比對(duì)以及點(diǎn)突變的方法我們證實(shí)了BIV Vif上與btCullin2之間相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)為C-x1-C-x1-H-x19-C基序。鋅親和層析實(shí)驗(yàn)表明BIV Vif與Zn2+間的相互結(jié)合依賴于C-x1-C-x1-H-x19-C基序，它是與以往報(bào)道的Zn指結(jié)構(gòu)都不盡相同的一個(gè)全新的Zn2+結(jié)合環(huán)。MVVVif雖與Cullin5相結(jié)合，但在MVVVif上未發(fā)現(xiàn)Cul5-box或HCCH基序，并且MVV Vif對(duì)宿主APOBEC3蛋白的降解幾乎不受TPEN的影響，說(shuō)明MVV Vif介導(dǎo)的降解不依賴Zn2+的參與，這些都暗示MVV Vif與oaCul5之間的相互作用方式不同于HIV-1或SIV Vif。 本論文的第二部分內(nèi)容是利用宿主限制因子的種屬特異性，對(duì)病毒進(jìn)行改造，試圖突破種屬間傳播的限制瓶頸。1981年艾滋病發(fā)現(xiàn)至今短短30余年時(shí)間里，全球已有超過(guò)3400萬(wàn)人感染艾滋病。然而沒(méi)有合適的動(dòng)物模型是阻礙艾滋病藥物與疫苗開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵因素之一�，F(xiàn)階段用于研究艾滋病的動(dòng)物模型有兩種：一種是HIV-1感染黑猩猩和SCID/hu鼠，但是它們的有效性和疾病特征嚴(yán)重限制了其應(yīng)用。另一種是用猴免疫缺陷病毒SIV或經(jīng)改造的SHIV感染恒河猴，盡管這種動(dòng)物模型對(duì)于研究發(fā)病機(jī)理很有效，但由于SIV與HIV之間的差異，致使這種感染不能完全模擬HIV對(duì)人類的感染。因此該動(dòng)物模型對(duì)于艾滋病治療藥物以及疫苗的評(píng)價(jià)存在一定的缺陷。那么，構(gòu)建更加完善的用于評(píng)價(jià)艾滋病疫苗或藥物的動(dòng)物模型將有助于推動(dòng)全球艾滋病的治療。 猴分為兩大種類：一種是新世界猴，如松鼠猴和通常的絨猴；另外一種是舊世界猴，如非洲綠猴（African green monkey, agm）和恒河猴（Rhesus Macacus, mac）。HIV在感染新世界猴的侵入階段就被阻斷，原因是病毒包膜蛋白gp120與細(xì)胞表面受體蛋白CD4和CCR5之間不能有效的相互作用。雖然HIV能有效的侵入舊世界猴，但在侵入后階段受到宿主細(xì)胞限制因子的制約，導(dǎo)致病毒不能有效復(fù)制。三種宿主限制因子解釋了侵入后阻斷：三維基體蛋白5α（TRIM5α）和脂蛋白APOBEC3家族以及膜蛋白BST2。在本論文中，我們通過(guò)對(duì)HIV-1的NL43病毒株骨架進(jìn)行基因替換來(lái)解除HIV-1感染舊世界猴的限制因素。人源的TRIM5α，APOBEC3以及BST-2能夠分別被HIV-1的CA， Vif以及Vpu所拮抗，但恒河猴的同源宿主限制因子不能被HIV-1的CA,Vif以及Vpu拮抗，而是能夠被SIVmac239的CA, Vif以及HIV-1稀有亞型DH12的Vpu所拮抗。我們將HIV-1的CA，，Vif以及Vpu的穿膜區(qū)基因分別替換成SIVmac239的CA，Vif以及HIV-1DH12的Vpu穿膜區(qū)，獲得了stHIV-1嵌合病毒質(zhì)粒。我們?cè)?93T細(xì)胞中檢測(cè)到嵌合病毒stHIV-1的結(jié)構(gòu)蛋白的正常表達(dá)，并且能夠成功包裝出病毒顆粒。在此基礎(chǔ)上，我們通過(guò)MAGI-CCR5細(xì)胞檢測(cè)了包裝出的病毒顆粒對(duì)人類細(xì)胞的感染能力，發(fā)現(xiàn)嵌合病毒能夠成功感染人類MAGI細(xì)胞。替換部分的蛋白功能的驗(yàn)證結(jié)果表明：stHIV-1的Vif能夠有效降解恒河猴的A3G蛋白，并且替換的Vpu能夠拮抗Rh BST-2對(duì)病毒出毒的抑制。在檢測(cè)stHIV-1的CA功能實(shí)驗(yàn)中，我們沒(méi)能成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)恒河猴TRIM5α的人類T淋巴細(xì)胞系CEM×174，因此對(duì)于CA的功能驗(yàn)證需要在今后的stHIV-1感染恒河猴PBMC實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行間接驗(yàn)證。此外，我們還成功的檢測(cè)到stHIV-1在CEM×174細(xì)胞系中的長(zhǎng)期復(fù)制。在下一步計(jì)劃中，我們需要完成在Rh PBMC細(xì)胞中檢測(cè)stHIV-1的長(zhǎng)期復(fù)制曲線，在此基礎(chǔ)上對(duì)恒河猴進(jìn)行病毒功毒以及病毒傳代實(shí)驗(yàn)，我們希望改造的病毒能夠在恒河猴體內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制并且最終能導(dǎo)致恒河猴的致病。 本論文的研究補(bǔ)充了BIV Vif-btA3Z2-Z3以及MVV Vif-oaA3Z2-Z3蛋白之間相互拮抗作用的機(jī)制，為病毒在牛羊中的疾病進(jìn)程以及潛在的種屬間感染提供可參考的意義。另外stHIV-1的構(gòu)建有望成為更加理想的AIDS動(dòng)物模型，推動(dòng)AIDS治療藥物及疫苗的發(fā)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R512.91

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張興杰;王睿睿;鄭永唐;;基于Vif-APOBEC3G相互作用的抗HIV-1藥物研究[J];國(guó)際藥學(xué)研究雜志;2010年04期

2 陳倩倩;徐慶剛;張馳宇;;HIV輔助蛋白拮抗細(xì)胞限制因子機(jī)制研究進(jìn)展[J];病毒學(xué)報(bào);2014年01期

3 Ai-Hua LEI;Gao-Hong ZHANG;Ren-Rong TIAN;Jia-Wu ZHU;Hong-Yi ZHENG;Wei PANG;Yong-Tang ZHENG;;Replication potentials of HIV-1/HSIV in PBMCs from northern pigtailed macaque (Macaca leonina)[J];動(dòng)物學(xué)研究;2014年03期

4 劉文斌;鄧陽(yáng);于浩義;曹廣文;;APOBECs家族成員在癌癥進(jìn)化發(fā)育過(guò)程中的核心作用[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2014年12期

5 吳小霞;;APOBEC家族的功能研究進(jìn)展[J];成都工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào);2015年02期

6 隋洪帥;韓婧婉;楊紹敏;賈磊;劉永健;李敬云;李林;;我國(guó)云南部分HIV-1感染者黏合素蛋白基因單核苷酸多態(tài)性研究[J];軍事醫(yī)學(xué);2013年07期

7 李靖;譚曉華;何淼;劉如錦;王小波;楊磊;;病毒巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-Ⅱ?qū)d脂蛋白B mRNA編輯酶催化樣蛋白3G和正常T細(xì)胞表達(dá)分泌的調(diào)節(jié)活化蛋白表達(dá)的影響[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2014年21期

8 Joel da Cunha;Luciana Morganti Ferreira Maselli;Ana Carolina Bassi Stern;Celso Spada;Sérgio Paulo Bydlowski;;Impact of antiretroviral therapy on lipid metabolism of human immunodeficiency virus-infected patients: Old and new drugs[J];World Journal of Virology;2015年02期

9 朱艷萍;蔣建東;彭宗根;;APOBEC3G抑制病毒復(fù)制作用機(jī)制研究進(jìn)展[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2014年01期

10 羅明洲;彭程;董衛(wèi)國(guó);;APOBEC3F剪接亞型與全長(zhǎng)APOBEC3F、APOBEC3G對(duì)乙肝病毒作用的比較[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2014年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王宇迪;HIV-1 Vif誘導(dǎo)蛋白酶體途徑降解APOBEC3蛋白過(guò)程中泛素化作用的研究[D];吉林大學(xué);2011年

2 張文艷;HIV-1和其它種屬Vif蛋白抑制APOBEC3蛋白抗病毒活性的機(jī)制研究[D];吉林大學(xué);2008年

3 何智文;HIV-1 Vif中與APOBEC3G和APOBEC3F功能相關(guān)的保守結(jié)構(gòu)域的研究[D];浙江大學(xué);2010年

4 高國(guó)振;宿主因子Cyclin T1和Sam68在Ⅰ型人免疫缺陷型病毒生活周期中的功能研究[D];武漢大學(xué);2012年

5 倪小菊;HIV整合酶對(duì)鏈轉(zhuǎn)移抑制劑的易感性和耐藥性研究以及新型抗整合酶單域抗體的研發(fā)[D];華東師范大學(xué);2011年

6 曹穎;HIV-1感染者Vpr基因多態(tài)性及其臨床意義研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

7 孟佳子;人源HIV-1廣譜中和Fab抗體的鑒定[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

8 慕永新;乙型肝炎病毒X蛋白促進(jìn)人免疫缺陷病毒轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制研究[D];武漢大學(xué);2010年

9 龐曉靜;BRET方法研究BST-2和HIV-1 Vpu相互作用及小分子化合物抑制劑的篩選[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

10 吳佳;APOBEC3G在胰腺癌中分子機(jī)制及其關(guān)鍵靶蛋白研究[D];浙江大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李國(guó)慶;重組HIV-1 Vif 158的表達(dá)、復(fù)性與純化研究[D];西北大學(xué);2011年

2 張嫻;黃酮類Vif-A3G拮抗劑的設(shè)計(jì)與合成[D];大連理工大學(xué);2011年

3 陳弘;上海、山西地區(qū)HIV-1分離株vif基因序列分析[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

4 唐志姣;用于核苷固相合成化合物的合成與應(yīng)用[D];長(zhǎng)沙理工大學(xué);2013年

5 李沂;IFITM1\2\3的克隆表達(dá)及其抗病毒作用研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

6 張志鑫;APOBEC3G/F-Vif相互作用的模型構(gòu)建及在抗HIV-1藥物虛擬篩選中的應(yīng)用[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

7 鞠斌;攜帶HIV-1 pol基因的新型SHIV嵌合病毒的構(gòu)建及生物特性分析[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

8 鄭意文;虎紋蛙病毒（TFV）粒子中宿主蛋白Caveolin1的鑒定[D];中山大學(xué);2013年

9 張?chǎng)?HIV-1兩對(duì)重要蛋白質(zhì)相互作用的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

10 黃劍;苯并二氫吡喃類化合物抗HIV-1藥效學(xué)及作用機(jī)理的研究[D];北京工業(yè)大學(xué);2013年

本文編號(hào)：1587985