本文選題：內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞　切入點(diǎn)：條件培養(yǎng)基　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景和目的研究表明,內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞(Endothelial colony-forming cells,ECFCs)移植對糖尿病創(chuàng)面愈合具有促進(jìn)作用,但因利用率低、療效不明確及存在倫理學(xué)爭議等因素,其應(yīng)用受到了阻礙。利用細(xì)胞的旁分泌效應(yīng)可有效避免以上問題,因此,我們旨在深入了解ECFCs的細(xì)胞學(xué)特征以及探討ECFCs條件培養(yǎng)基(Conditioned medium,CM)對于成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞生物行為的影響,為ECFCs-CM在促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法采用密度梯度離心法從人臍帶血中分離單個核細(xì)胞,將后者在特定培養(yǎng)環(huán)境下誘導(dǎo)培養(yǎng)出內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞,并采用流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測、免疫熒光染色及Matrigel基質(zhì)膠成管試驗等對細(xì)胞進(jìn)行鑒定,對比第1代和第10代細(xì)胞的表型及功能。制備無血清ECFCs-CM,并采用抗體芯片及ELISA法對其中的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測。采用無血清EBM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照,應(yīng)用CCK-8法、Transwell共培養(yǎng)法及細(xì)胞劃痕實驗、Anne×inV-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測 ECFCs-CM 對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)和人真皮成纖維細(xì)胞(Human dermal fibroblasts,HDFs)增殖、遷移及凋亡的影響,并采用Matrigel基質(zhì)膠成管實驗檢測ECFCs-CM對HUVECs成管能力的影響。結(jié)果原代培養(yǎng)的細(xì)胞呈“鋪路石”樣生長,細(xì)胞個體呈近橢圓形或紡錘體形,體外連續(xù)傳代時,細(xì)胞形態(tài)無明顯變化;流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測結(jié)果顯示第1代和第10代均高表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記KDR、CD144,不表達(dá)單核巨噬細(xì)胞標(biāo)記CD45,兩代細(xì)胞以上三種表面標(biāo)志物表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),第1代細(xì)胞高表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記CD34,而第10代表達(dá)率降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),第1代細(xì)胞低表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記CD133,第10代幾乎不表達(dá),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);免疫熒光染色結(jié)果顯示第1代和第10代細(xì)胞Dil-acLDL攝取及FITC-UEA-I結(jié)合雙陽性;Matrigel基質(zhì)膠成管試驗結(jié)果顯示第1代和第10代細(xì)胞均可在基質(zhì)膠中可形成管腔樣結(jié)構(gòu)�？贵w芯片檢測結(jié)果顯示,ECFCs-CM 高表達(dá) PDGF-BB、Angiopoietin-2、Angiogenin、MCP-3、ICAM-2、LAP等34種細(xì)胞因子,ELISA法定量檢測結(jié)果顯示,ECFCs-CM中PDGF-BB、IL-8、EGF 的含量分別為 4627.42±457.51pg/ml、4111.36±129.77pg/ml、1679.71±113.35pg/ml(濃度均以 1×106cells/2ml 為標(biāo)準(zhǔn));CCK-8 法結(jié)果顯示,實驗組HUVECs及HDFs在24h、48h及72h增殖活性均高于對照組(P0.05);Transwell共培養(yǎng)結(jié)果顯示,與對照組相比,實驗組HUVECs和HDFs在單位時間內(nèi)細(xì)胞遷移數(shù)均高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,實驗組HUVECs和HDFs遷移率在各時間點(diǎn)均高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,實驗組HUVECs晚期凋亡、死亡率低于對照組(P0.01),實驗組HDFs早期凋亡和晚期凋亡、死亡率均低于對照組(P0.05);Matrigel基質(zhì)膠成管實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,實驗組HUVECs在基質(zhì)膠上形成管狀結(jié)構(gòu)和節(jié)點(diǎn)數(shù)目均提高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論本研究中,ECFCs在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)時,細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定,表型及功能未發(fā)生明顯變化,且ECFCs-CM中包含豐富的細(xì)胞因子,其中多種為促創(chuàng)面愈合因子,說明ECFCs是研究干/祖細(xì)胞旁分泌效應(yīng)對創(chuàng)面愈合作用的理想細(xì)胞來源;ECFCs-CM可促進(jìn)HUVECs和HDFs的增殖及遷移能力,并抑制它們在血清饑餓環(huán)境下的凋亡,且可促進(jìn)HUVECs的成管能力,預(yù)示了其在創(chuàng)面愈合方面的潛在應(yīng)用價值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2;R641

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1578031