本文關鍵詞： Caveolin-3 2型糖尿病 基因突變 糖代謝 GLUT-4　出處：《廣西醫(yī)科大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：[目的]2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)的遺傳背景與基因多態(tài)性密切相關。Caveolin-3 (Cav-3)是肌肉特異性蛋白,它可以調(diào)節(jié)胰島素信號通路。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)T2DM病人Cav-3基因外顯子存在多處變異位點。為了觀察Cav-3基因突變是否影響胰島素受體信號途徑,改變骨骼肌細胞糖代謝,從而參與T2DM的發(fā)病機制,我們將Cav-3 K15N突變基因?qū)隒2C12細胞,對其表達的突變蛋白進行相關功能研究。[方法]利用生物信息學預測Cav-3第一外顯子K15N (KU971296)、 D16H和N33N三個突變點蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu),然后選擇二級結(jié)構(gòu)改變明顯的K15N突變進行研究。分別構(gòu)建陰性對照組、野生型組以及Cav-3 K15N突變組表達載體轉(zhuǎn)染C2C12細胞。G418篩選后,胰島刺激30min,運用Western Blot技術和IF技術鑒定Cav-3、AKT、pAKT以及GLUT-4等蛋白的表達情況；在12h、24h測定C2C12肌細胞對葡萄糖的攝取量和36h細胞內(nèi)糖原合成量。[結(jié)果]1.分析發(fā)現(xiàn)K15N、D16H屬于錯義突變,N33N屬于同義突變。生物信息學預測Cav-3蛋白質(zhì)二級無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)變?yōu)槁菪Y(jié)構(gòu)的有K15N和D16H兩個位點。2.經(jīng)400μg/ml的G418篩選后,得到穩(wěn)定表達的細胞系。Westernblot鑒定證實篩選成功,組間轉(zhuǎn)染效率沒有統(tǒng)計學差異。3.與野生型組相比,K15N突變使骨骼肌細胞Cav-3蛋白總體表達降低,而且富集在細胞核周圍,細胞膜分布減少。其下游信號分子AKT磷酸化減少,但總AKT蛋白表達水平無明顯變化。細胞GLUT-4蛋白不僅總體表達水平下降,而且在細胞膜上聚集成團。4.Cav-3 K15N突變蛋白導致C2C12細胞對葡萄糖攝取減少。在12h,K15N突變組與陰性對照組和野生型組相比,p值分別等于0.042和0.000；在24h,K15N突變組與野生型組比較p=0.010,有顯著的統(tǒng)計學差異,但是與陰性對照組相比p=0.366,沒有統(tǒng)計學意義。在36小時K15N突變組細胞糖原合成減少(p0.050)。[結(jié)論]Cav-3 K15N突變導致C2C12細胞膜Cav-3表達減少,影響胰島素信號通路上AKT磷酸化和GLUT-4蛋白的轉(zhuǎn)位,導致骨骼肌細胞葡萄糖攝取障礙,糖原合成減少。我們推測骨骼肌細胞利用葡萄糖減少可能會引起高血糖,是促使T2DM發(fā)生發(fā)展的機制之一。
[Abstract]:[objective] the genetic background of type 2 diabetes mellitus type 2 diabetes mellitus (T2DM) is closely related to gene polymorphism. Caveolin-3 Cav-3) is a muscle-specific protein. In order to observe whether the mutation of Cav-3 gene affects insulin receptor signaling pathway and changes glucose metabolism in skeletal muscle cells, we found that there are many mutation sites in the exon of Cav-3 gene in T2DM patients. In order to participate in the pathogenesis of T2DM, we introduced the Cav-3 K15N mutation gene into C2C12 cells. [methods] Bioinformatics was used to predict the secondary structures of three mutant proteins, K15N, KU971296, D16H and N33N, in the first exon of Cav-3. Then the K15N mutation with obvious changes in secondary structure was selected to construct negative control group, wild-type group and Cav-3 K15N mutant expression vector transfected into C2C12 cells. G418 was used to screen the expression vector. After 30 minutes of islet stimulation, Western Blot and if techniques were used to identify the expression of Cav-3AK Blot and GLUT-4 protein. The glucose uptake of C2C12 myocytes and the intracellular glycogen synthesis in C2C12 cells were determined at 12h and 24h. [results] 1. It was found that K15N D16H belongs to synonymous mutation. Bioinformatics predicts the secondary irregular convolution structural change of Cav-3 protein. They were K15N and D16H loci with helical structure. After screening with 400 渭 g / ml G418, The stable expressed cell line. Western blot confirmed that the selection was successful, and the transfection efficiency was not significantly different between the two groups. Compared with the wild type group, K15N mutation decreased the overall expression of Cav-3 protein in skeletal muscle cells and enriched around the nucleus. The distribution of cell membrane decreased, the phosphorylation of downstream signal molecule AKT decreased, but the expression level of total AKT protein did not change significantly. The expression level of GLUT-4 protein not only decreased, but also decreased. Cav-3 K15N mutant protein decreased glucose uptake of C2C12 cells at 12h, which was equal to 0.042 and 0.000 in 12h K15N mutation group compared with negative control group and wild type group, respectively, and compared with wild type group at 24 h after Cav-3 K15N mutation. There was a significant statistical difference between the two groups. However, compared with the negative control group, there was no statistical significance. The glycogen synthesis in the K15N mutant group decreased p0.050 at 36 hours. [conclusion] the Cav-3 K15N mutation resulted in the decrease of Cav-3 expression on the C2C12 cell membrane, which affected the phosphorylation of AKT and the translocation of GLUT-4 protein in the insulin signaling pathway. We speculate that the decrease in glucose utilization by skeletal muscle cells may lead to hyperglycemia, which is one of the mechanisms that promote the development of T2DM.
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.1

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