本文關(guān)鍵詞： 胰高血糖素 胰島素分泌 2型糖尿病 DAG-PKC信號(hào)通路　出處：《石河子大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:通過(guò)探討不同濃度的胰高血糖素(Glucagon,GC)及不同濃度葡萄糖(Glucose,Glu)刺激對(duì)胰島β細(xì)胞系MIN6細(xì)胞中胰島素(insulin,Ins)分泌的影響及對(duì)二脂酰甘油(Diacylglycerol,DAG)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)表達(dá)的影響,進(jìn)一步明確GC對(duì)胰島素分泌的作用及機(jī)制。方法:1.對(duì)小鼠胰島瘤細(xì)胞株MIN6細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),生長(zhǎng)到一定細(xì)胞密度之后進(jìn)行傳代及分組,在不同Glu濃度即無(wú)糖(0mmol/L)、低糖(2.8mmol/L)及高糖(16.7mmol/L)和不同GC濃度即無(wú)GC(0ng/L)、低濃度GC(100ng/L)、中濃度GC(500ng/L)及高濃度GC(1000ng/L)的刺激作用下收集細(xì)胞培養(yǎng)皿中的上清液,采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)DAG濃度的水平;2.將敏感的熒光生物傳感器CKAR(PKC表達(dá)的質(zhì)粒)及陰性對(duì)照空質(zhì)粒PCDNA3.1采用真核細(xì)胞電穿孔的方法轉(zhuǎn)染入MIN6細(xì)胞中,在不同Glu及不同GC濃度刺激因素下采用基于熒光生物傳感器的熒光能量共振轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)的技術(shù)觀察細(xì)胞熒光的變化從而實(shí)時(shí)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)PKC含量的表達(dá);3.采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)胰島素分泌的水平。結(jié)果:1.ELISA法檢測(cè)不同濃度Glu及不同濃度GC刺激下MIN6細(xì)胞上清液中DAG含量的結(jié)果如下:(1)在低糖和高糖濃度條件下,隨著GC濃度的升高,DAG含量也隨之升高,趨勢(shì)明顯,且高糖濃度下,DAG增加趨勢(shì)較低糖濃度下增加趨勢(shì)更加明顯;在無(wú)糖濃度條件下高濃度GC刺激下DAG濃度沒(méi)有隨GC濃度升高而升高的趨勢(shì)。(2)不同GC濃度組間進(jìn)行比較:無(wú)糖條件下,中GC組DAG水平高于無(wú)GC組(P0.05);低糖條件下:高、中、低GC組DAG水平均高于無(wú)GC組(P0.05),高GC高于低GC組(P0.001),高GC組DAG水平高于中GC組(P0.001);高糖環(huán)境下:高、中GC組DAG水平均高于無(wú)GC組(P0.001),高GC組DAG水平高于低GC組(P0.001),高GC組DAG水平高于中GC組(P0.05)。2.基于熒光生物傳感器的FRET技術(shù)檢測(cè)MIN6細(xì)胞內(nèi)PKC含量的變化:轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒:加入1000ng/LGC+16.7Glu處理組后與空白對(duì)照組kreb液相比CFP/YFP比值無(wú)明顯差異P0.05;轉(zhuǎn)染PKC質(zhì)粒CKAR后:(1)無(wú)糖時(shí),在低濃度GC及中濃度GC刺激下,CFP/YFP比值曲線上升,曲線上升趨勢(shì)平緩,且中濃度GC刺激下較低濃度GC刺激下CPP/YFP比值差異明顯(P0.05);高濃度GC刺激后,CFP/YFP曲線沒(méi)有上升的趨勢(shì)。(2)在低糖條件下,給予低濃度及中濃度GC處理CFP/YFP比值曲線上升,上升趨勢(shì)平緩,且中濃度GC刺激較低濃度刺激時(shí)相比CFP/YFP比值差異明顯(P0.05);給予高濃度GC刺激后,CFP/YFP曲線繼續(xù)上升,上升趨勢(shì)較明顯,較低濃度GC及中濃度GC刺激階段相比比值升高(P0.05)。(3)在高糖條件下,給予低濃度及中濃度GC處理CFP/YFP比值曲線上升,上升趨勢(shì)平緩,給予高濃度GC刺激后,CFP/YFP曲線繼續(xù)上升,上升趨勢(shì)較明顯,較低濃度GC及中濃度GC刺激階段相比比值升高(P0.05)。3.ELISA法檢測(cè)不用濃度GC及不同濃度Glu刺激下MIN6細(xì)胞上清液中胰島素含量的結(jié)果如下:(1)在無(wú)糖,低糖,高糖濃度下,隨著GC濃度的增加,MIN6細(xì)胞胰島素分泌量也隨之增加,且隨著葡萄糖濃度由低到高,胰島素分泌量增加趨勢(shì)越明顯,在高糖濃度下,胰島素濃度增加趨勢(shì)最大。(2)不同GC濃度組間進(jìn)行比較:無(wú)糖條件下,高、中、低GC組胰島素濃度均高于無(wú)GC組(P0.01),高GC組胰島素濃度高于低中GC組(P0.01);低糖條件下,高GC和中GC組胰島素濃度均高于無(wú)GC組(P0.01),高GC組高于低GC組(P0.01);高糖條件下,高GC和中GC組胰島素濃度均高于無(wú)GC組(P0.05),高GC和中GC組均高于低GC組(P0.01),高GC組高于中GC組(P0.01);結(jié)論:1.GC可能以濃度梯度的形式通過(guò)增加第二信使信號(hào)通路DAG-PKC通路中DAG及PKC含量從而增加MIN6細(xì)胞中胰島素的分泌。2.GC通過(guò)DAG-PKC通路增加胰島素分泌的作用具有一定的葡萄糖依賴性。
[Abstract]:Objective: To explore the effect of different concentrations of glucagon (Glucagon, GC) and different concentrations of glucose (Glucose, Glu) stimulation on MIN6 cell insulin in islet beta cell lines (insulin, Ins) and the secretion of two acyl glycerol (Diacylglycerol, DAG), protein kinase C (protein kinase C. PKC) on the expression of GC, to further clarify the role and mechanism of insulin secretion. Methods: 1. of mouse insulinoma cell line MIN6 cells were cultured in vitro, growth to after a certain cell density were passaged and grouped in different Glu concentration is sugar free, low sugar (0mmol/L) (2.8mmol/L) and high glucose (16.7mmol/L) and the different concentration of GC is GC (0ng/L), low concentration of GC (100ng/L), GC (500ng/L) concentration and high concentration of GC (1000ng/L) culture supernatant in the dish collection of cell stimulation, using enzyme-linked immunosorbent method (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) detection of DAG 嫻撳害鐨勬按騫，

本文編號(hào)：1554878