本文關(guān)鍵詞： 高糖 Runx2 成骨分化 PI3K/AKT Wnt/β-catenin　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:糖尿病是一類以高血糖為主要特征的慢性全身性代謝性疾病,分為胰島素分泌缺陷型(I型),胰島素作用障礙型(II型),或者兩者兼有。糖尿病骨病患者涉及多種病原,其中包括遺傳因素、環(huán)境因素或者后天因素,但是越來越多研究表明高血糖是糖尿病骨病最重要的病原。研究表明,糖尿病骨病中的高血糖破壞成骨功能,如基質(zhì)形成、礦化等。研究表明Runx2是成骨分化過程中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,是多條信號通路的交匯點(diǎn)。PI3K/AKT信號通路是胰島素信號通路中重要的一部分,調(diào)節(jié)著糖原合成;Wnt/β-catenin信號通路是經(jīng)典的成骨通路。目前本課題組研究已經(jīng)證實(shí),高糖環(huán)境下干細(xì)胞成骨分化能力減弱,但是具體怎樣引起成骨能力的下降目前還不明確。因此,本研究將在體外轉(zhuǎn)染外源性Runx2,從分子生物學(xué)方面檢測Runx2在高糖環(huán)境下對干細(xì)胞成骨分化的作用,并從信號通路方面研究其中的調(diào)控機(jī)制。方法:第一部分:從雄性SD大鼠股骨獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,體外培養(yǎng)并通過成骨、成脂以及成軟骨誘導(dǎo)分化來鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。在體外用不同含糖量培養(yǎng)基模擬高糖高滲環(huán)境,通過cck-8和流式細(xì)胞儀檢測不同糖濃度和等滲環(huán)境中細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖的變化,同時用alp活性、alp染色和茜素紅染色等分子生物學(xué)手段檢測細(xì)胞礦化能力。第二部分:根據(jù)前面的研究結(jié)果,以25mm糖濃度作為高糖濃度。轉(zhuǎn)染外源性runx2質(zhì)粒,并用qrt-pcr和westernblot驗(yàn)證質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是否成功。探索runx2在高糖環(huán)境中的作用,用alp染色和茜素紅染色來檢測成骨分化能力,同時用qrt-pcr檢測runx2、alp、oc和opnmrna的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染外源性runx2質(zhì)粒后,用westernblot檢測信號通路上主要信號分子akt、p-akt、gsk3β、p-gsk3β和β-catenin蛋白表達(dá)水平,用免疫熒光檢測β-catenin亞細(xì)胞定位分布。結(jié)果:第一部分:體外分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠進(jìn)行成脂、成骨及成軟骨分化。體外模擬高糖高滲狀態(tài),在一定糖濃度范圍內(nèi)(5.5mm-25mm),隨著糖濃度升高,細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),但是對應(yīng)的等滲組抑制細(xì)胞增殖。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后,隨著糖濃度身高,礦化能力降低,成骨能力降低,但是等滲組成骨礦化能力并沒有明顯改變。第二部分:轉(zhuǎn)染外源性runx2質(zhì)粒,westernblot和qrt-pcr驗(yàn)證runx2轉(zhuǎn)染成功并高效表達(dá)。轉(zhuǎn)染外源性runx2質(zhì)粒,成骨相關(guān)基因runx2、alp、oc及opnmrna表達(dá)顯著提高,成骨礦化能力提高。轉(zhuǎn)染外源性Runx2質(zhì)粒,細(xì)胞信號通路主要信號分子p-AKT、p-GSK3β和β-catenin蛋白表達(dá)量上調(diào),p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β和β-catenin/β-actin比例增加。應(yīng)用10uM PI3K/AKT抑制劑LY294002后,p-GSK3β和β-catenin蛋白表達(dá)量下調(diào),p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β和β-catenin/β-actin比例下降。免疫熒光結(jié)果顯示生理糖濃度組β-catenin分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,高糖環(huán)境下β-catenin大部分集聚在細(xì)胞質(zhì)中,轉(zhuǎn)染外源性Runx2質(zhì)粒促進(jìn)β-catenin累積入核,大部分分布在細(xì)胞核中。結(jié)論:1.高糖環(huán)境下,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),成骨礦化能力減弱。2.轉(zhuǎn)染外源性Runx2質(zhì)粒減弱了高糖對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的抑制作用。3.PI3K/AKT信號通路是胰島素信號通路的核心部分,PI3K/AKT通路與經(jīng)典成骨信號Wnt/β-catenin通路可以經(jīng)GSK3β產(chǎn)生相互效應(yīng),高糖環(huán)境可通過PI3K/AKT通路使p-GSK3β降低,抑制Wnt通路中β-catenin表達(dá),使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨能力下降,轉(zhuǎn)染Runx2后可一定程度上逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)。
[Abstract]:Objective : To investigate the effects of exogenous runx2 on bone marrow mesenchymal stem cells in diabetic patients . The expression of 尾 - catenin and 尾 - catenin / 尾 - actin in bone marrow mesenchymal stem cells decreased .

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2;R68

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1546786