本文關(guān)鍵詞： 家蠶 HSP70蛋白 過敏原 哮喘模型　出處：《深圳大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：養(yǎng)蠶在中國已有5000年歷史,養(yǎng)蠶業(yè)在中國規(guī)模龐大,參與人員眾多,家蠶的廣泛養(yǎng)殖以及隨之而來的蠶絲用品的大量使用導(dǎo)致家蠶過敏時有發(fā)生。家蠶過敏臨床表現(xiàn)以過敏性哮喘為主,伴有過敏性鼻炎、結(jié)膜炎和過敏性皮炎。本研究結(jié)合蛋白組學(xué)和免疫學(xué)方法首次發(fā)現(xiàn)家蠶新過敏原HSP70蛋白,利用分子生物學(xué)方法成功克隆表達出重組HSP70蛋白,重組HSP70蛋白與家蠶過敏患者血清具有很強的免疫原性,并用其成功致敏小鼠建立了哮喘模型進一步驗證了其免疫原性,最后通過細胞實驗初步探討了其致敏機理,這為家蠶引發(fā)的過敏的特異性治療和診斷奠定了良好的基礎(chǔ)。目的(1)通過蛋白組學(xué)和Western blotting(WB)的方法篩選出家蠶潛在的過敏蛋白并進行質(zhì)譜鑒定。(2)獲取過敏原HSP70的全基因序列,構(gòu)建表達載體,誘導(dǎo)表達獲得大量重組HSP70蛋白并進行免疫學(xué)鑒定。(3)通過HSP70重組蛋白建立小鼠過敏性哮喘模型,評價其免疫原性。(4)通過細胞實驗初步探討家蠶HSP70致敏機制。方法(1)從廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所獲取實驗所用的家蠶,提取家蠶總蛋白,進行2-D分離蛋白,再將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,封閉后將膜與家蠶過敏患者血清進行共同孵育,后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人Ig E抗體反應(yīng)尋找其中的陽性斑點;取其中的7號斑點切膠酶解后,進行MALDI-TOF-MS分析,通過與家蠶肽指紋圖譜進行比對鑒定該斑點;(2)合成HSP70蛋白基因并將其構(gòu)建到pet-28a表達載體上,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21,IPTG誘導(dǎo)基因表達,通過NI-NAT親和層析獲取高純度蛋白;對重組蛋白進行過敏原性鑒定,包括WB實驗、ELISA實驗。(3)選用30只6-8周齡的BALB/c小鼠,飼養(yǎng)在SPF動物房,隨機分為3組:粉塵螨粗提液組(HDM組)、HSP70重組蛋白組(HSP70組)和生理鹽水對照組(control組)。HDM組用100μg塵螨粗浸液加4 mg氫氧化鋁佐劑皮下注射致敏,HSP70組用100μg家蠶重組HSP70加4 mg氫氧化鋁佐劑皮下注射致敏,control組注射等量生理鹽水代替過敏原。第3、7天加強致敏,在第14天,HDM組和HSP70組同時用50μg塵螨粗浸液和重組HSP70蛋白滴鼻激發(fā)小鼠,control組用等量的生理鹽水代替變應(yīng)原。同樣的方式連續(xù)7天,每天一次。第23天,利用乙酰甲膽堿誘導(dǎo)小鼠檢測氣道高反應(yīng)性。第24天,脫頸處死小鼠,檢測小鼠哮喘相關(guān)指標(biāo)。(4)用重組家蠶HSP70蛋白刺激DC2.4細胞,通過流式細胞術(shù)方法檢測共刺激分子CD40和CD80的表達。結(jié)果(1)通過蛋白組學(xué)和免疫學(xué)方法成功篩選出8個潛在過敏原,7號陽性斑點免疫原性較強,進行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜后,利用軟件Mascot等搜索課查找到對應(yīng)的開放閱讀框(ORF)。(2)克隆HSP70蛋白基因序列并成功構(gòu)建出p ET28a-HSP70表達載體,在大腸埃希桿菌E.coli BL21內(nèi)高效表達,用NI-NAT親和層析純化獲得大量可溶性重組蛋白。ELISA和Western Blot實驗也表明家蠶HSP70蛋白與家蠶過敏患者陽性患者的血清內(nèi)Ig E有較強的結(jié)合能力,而健康對照組結(jié)果為陰性。(3)利用乙酰甲膽堿誘導(dǎo)小鼠檢測氣道高反應(yīng)性,結(jié)果顯示:與control對比,家蠶HSP70蛋白組表現(xiàn)出明顯的氣道高反應(yīng)性,隨著乙酰甲膽堿濃度的逐步提高,其Penh值也不斷增強。且該差異性具有顯著性差異;利用ELISA方法檢測血清中抗原特異性Ig E顯示:HSP70組小鼠血清與家蠶HSP70重組蛋白反應(yīng)性(OD450)為正常對照組的3倍多,有顯著性差異(P㩳0.05);利用ELISA方法檢測血清中抗原特異性Ig G1結(jié)果顯示:HSP70組小鼠血清與家蠶HSP70重組蛋白反應(yīng)性(OD450)為正常對照組的5倍多,有顯著性差異(P㩳0.05);肺組織病理學(xué)切片可以看出:HDM組與HSP70蛋白致敏組小鼠肺組織支氣管壁增厚,且血管周圍支氣管周圍炎癥細胞浸潤,而正常組小鼠肺部支氣管輪廓清晰無明顯增厚,且在支氣管和血管組織周圍未發(fā)現(xiàn)炎癥細胞浸潤。結(jié)論本研究通過蛋白組學(xué)和免疫學(xué)方法首次發(fā)現(xiàn)了家蠶HSP70蛋白為其過敏原。通過構(gòu)建HSP70蛋白表達載體大量表達純化獲得重組HSP70蛋白,經(jīng)免疫學(xué)方法鑒定該蛋白具有良好的免疫原性。首次利用重組HSP70蛋白致敏小鼠建立了哮喘模型,進一步驗證了其免疫原性。通過細胞實驗也初步探討了其致敏機理。這為其他過敏原的發(fā)現(xiàn)提供思路,同時為家蠶引發(fā)的過敏疾病的特異性治療和診斷奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:The recombinant HSP70 protein was isolated from silkworm in Guangdong Academy of Agricultural Sciences and studied by Western blotting . ( 3 ) BALB / c mice were randomly divided into three groups : dust mite crude extract group ( HDM group ) , HSP70 recombinant protein group ( HSP70 group ) and normal saline control group ( control group ) . The results showed that HSP70 protein was significantly higher than that of normal control group ( P ? 0.05 ) . The results showed that the expression of HSP70 protein in serum of HSP70 group was more than that of normal control group ( P ? 0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R562.25;R-332;Q78

【參考文獻】

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1 王碩;蔣競雄;王燕;王姿歡;王婷;王惠珊;;城市0～24月齡嬰幼兒過敏性疾病癥狀流行病學(xué)調(diào)查[J];中國兒童保健雜志;2016年02期

2 劉傳合;洪建國;尚云曉;孫王君;多力坤·木扎帕爾;扇敏娜;高云;任筱，

本文編號：1545219