本文關(guān)鍵詞： 胰島素抵抗 胰敏素 胰島素 重組蛋白 Akt　出處：《南華大學(xué)》2015年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：世界衛(wèi)生組織的報(bào)告表明,目前世界上超重人數(shù)達(dá)14億之多,而肥胖者超過(guò)5億。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展,我國(guó)的肥胖人數(shù)呈快速增長(zhǎng)和低齡化的趨勢(shì),目前我國(guó)的肥胖人口已經(jīng)超過(guò)9000萬(wàn)人。肥胖是引起2型糖尿病(T2DM)和心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素。據(jù)預(yù)測(cè),到2025年糖尿病的發(fā)病率將達(dá)到全世界人口的6.1%,所以如何有效治療糖尿病,提高病人的生存質(zhì)量是當(dāng)今急需解決的研究?jī)?nèi)容。2型糖尿病是一種多因素的代謝型疾病,具有胰島p細(xì)胞功能缺失,胰島素抵抗,肝糖異生增加等特點(diǎn)。胰島素抵抗的主要特點(diǎn)為胰島素對(duì)靶器官組織的代謝調(diào)節(jié)功能的敏感性降低,是肥胖性糖尿病和心血管疾病之間最重要的介導(dǎo)因子。胰島素抵抗使骨骼肌、肝臟、腎、脂肪組織的葡萄糖利用率降低或者葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力降低,導(dǎo)致的葡萄糖脂質(zhì)代謝改變引起高糖血癥,是引起2型糖尿病繼發(fā)性并發(fā)癥的首要因素。因此,治療2型糖尿病的關(guān)鍵是提高胰島素敏感性,靶向增加葡萄糖攝取和降低糖異生。胰島素受體激活后作用于其下游的18個(gè)靶標(biāo)蛋白,其中包括Akt和ERK等。研究發(fā)現(xiàn)一種稱(chēng)為通路選擇性的胰島素抵抗和反應(yīng)模式(SEIRR),即糖尿病患者的肝臟在胰島素的刺激下對(duì)脂肪降低和葡萄糖降低的通路激活不足,但是卻能夠激活脂肪生成和MAP激酶通路。這一差異選擇性的激活和抑制,使所有降低血脂和血糖的通路都受到抵抗,而脂肪生成和MAP通路卻仍然對(duì)胰島素產(chǎn)生激活效應(yīng)。這種聯(lián)合效應(yīng)對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生了巨大威脅。因此,發(fā)生胰島素抵抗時(shí),SEIRR將會(huì)導(dǎo)致異常脂蛋白血癥和高糖血癥,從而出現(xiàn)粥樣動(dòng)脈硬化性等心血管疾病。這些心血管疾病仍然是糖尿病患者致死的主要原因。但是到目前為止SEIRR及其并發(fā)癥的分子機(jī)理仍然不清楚。這些復(fù)雜的機(jī)理的不確定性嚴(yán)重阻礙了我們對(duì)糖尿病的大部分致命性并發(fā)癥的病理生理機(jī)制的了解。并且,目前還沒(méi)有開(kāi)發(fā)出特異性的治療藥物來(lái)糾正SEIRR。目前臨床上常用的胰島素增敏劑有化學(xué)合成的羅格列酮和吡格列酮,屬于過(guò)氧化物酶增殖體激活受體(PPAR)的激動(dòng)劑,主要作用機(jī)制是使細(xì)胞膜上胰島素受體對(duì)胰島素的敏感性增加,促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖利用,但長(zhǎng)期服用會(huì)增加心肌梗死或中風(fēng)等缺血性心血管意外。所以迫切需要開(kāi)發(fā)新的副作用更小的藥物來(lái)提高胰島素受體的敏感性。以往的數(shù)據(jù)表明,發(fā)生胰島素抵抗時(shí),外周的胰島素仍然是具有生物學(xué)效應(yīng),但是由于胰島素受體與胰島素結(jié)合的親和力和敏感性降低,使胰島素受體的胞內(nèi)段酪氨酸基團(tuán)磷酸化受阻,導(dǎo)致一系列的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)生物鏈發(fā)生紊亂。另外,研究發(fā)現(xiàn)血液中存在細(xì)胞外游離于血液中的胰島素受體,游離狀態(tài)的胰島素受體能低親和力地與胰島素結(jié)合。并且肥胖及2型糖尿病動(dòng)物血中存游離胰島素受體濃度增加,可能游離胰島素受體結(jié)合胰島素后并不能把胰島素帶入靶細(xì)胞內(nèi),也不能激活胰島素信號(hào)通路。雖然胰島素與在游離狀態(tài)下的胰島素受體低親和力結(jié)合,但是在游離胰島素受體數(shù)量增加的情況下仍然可能降低胰島素對(duì)胰島素受體的刺激作用。首先我們構(gòu)建了一種新的重組蛋白,該蛋白具有人胰島素結(jié)合序列與人IgG4的Fc片段,這種重組蛋白具有高親和力的胰島素受體的胰島素結(jié)合結(jié)構(gòu)域,并且該重組蛋白與與胰島素結(jié)合后形成的二聚體能夠進(jìn)入到胰島素靶器官細(xì)胞內(nèi)激活胰島素信號(hào)通路,從而重新煥發(fā)胰島素的功能。命名這個(gè)新的蛋白為胰敏素。隨后從體內(nèi)體外試驗(yàn)證明胰敏素能夠提高胰島素抵抗細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性,激活A(yù)kt/ERK信號(hào)通路,抑制糖異生及促進(jìn)糖原合成,有效改善體外細(xì)胞和高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠對(duì)胰島素的敏感性。胰敏素的研究將為改善胰島素抵抗相關(guān)藥物開(kāi)發(fā)提供新的線(xiàn)索。第1章胰敏素重組蛋白的構(gòu)建及純化目的：構(gòu)建含有胰島素結(jié)合序列及IgG4Fc片段的重組蛋白,命名該重組蛋白為胰敏素,并進(jìn)行體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)。方法：(1)構(gòu)建表達(dá)INSR-IgG4Fc重組蛋白,命名為胰敏素,測(cè)序驗(yàn)證。(2)進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外表達(dá),利用親和層析柱純化該胰敏素蛋白,應(yīng)用SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色鑒定胰敏素蛋白純度和蛋白分子量大小。(3)確定胰敏素在肝細(xì)胞的最佳作用濃度和最佳作用時(shí)間。結(jié)果：(1)成功構(gòu)建了哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的胰敏素表達(dá)載體,應(yīng)用SDS-PAGE測(cè)定其分子量大小為33 kD。(2)在培養(yǎng)的肝細(xì)胞體系中,胰敏素能夠顯著激活A(yù)kt磷酸化,其最佳作用濃度為5 nM,最強(qiáng)作用時(shí)間為20 min。小結(jié)：(1)成功構(gòu)建了全新的純?nèi)嗽葱缘闹亟M蛋白INSR-IgG4Fc,即胰敏素。(2)胰敏素可以促進(jìn)Akt的磷酸化,最佳作用濃度是5nM,最佳作用時(shí)間是20分鐘。第2章胰敏素對(duì)肝細(xì)胞胰島素抵抗的改善及其機(jī)制目的：觀察胰敏素對(duì)軟脂酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞胰島素抵抗的改善,探討其作用機(jī)制。方法：(1)胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立及應(yīng)用：用0.3mM軟脂酸處理肝細(xì)胞16h構(gòu)建胰島素抵抗細(xì)胞模型,利用Western blot檢測(cè)胰島素對(duì)胰島素信號(hào)通路分子Akt的激活情況,以確定模型構(gòu)建成功。(2)觀察胰敏素對(duì)胰島素抵抗肝細(xì)胞的作用：利用ELISA檢測(cè)糖原、G6P和PEPCK的含量,利用qPCR檢測(cè)糖異生相關(guān)調(diào)控基因SIRT1、 PPARγ、 PGC-1α和PGC-1β的mRNA表達(dá),利用Western blot檢測(cè)胰島素通路IRS-1、Akt、ERK、JNK的激活狀態(tài)。(3)利用PI3K特異性抑制劑研究胰敏素的作用機(jī)制：利用qPCR檢測(cè)糖異生相關(guān)基因SIRT1、PPARγ、PGC-1α和PGC-1β的mRNA表達(dá),利用Western blot檢測(cè)PI3K、Akt、GSK3β的激活狀態(tài)。結(jié)果：(1)成功構(gòu)建肝細(xì)胞的胰島素抵抗模型。(2)胰敏素處理胰島素抵抗的肝細(xì)胞后能夠顯著增加糖原含量,減少G6P和PEPCK的含量,增加SIRT1和PPARy的mRNA表達(dá),降低PGC-1α的mRNA表達(dá),降低IRS-1的絲氨酸磷酸化水平,增加Akt和ERK的磷酸化激活。(3)PI3K特異性抑制劑預(yù)處理胰島素抵抗的肝細(xì)胞能夠阻斷胰敏素對(duì)胰島素通路的激活,并消除胰敏素對(duì)糖異生相關(guān)調(diào)控基因的影響。小結(jié)：(1)胰敏素通過(guò)影響肝細(xì)胞糖異生相關(guān)基因的表達(dá)抑制糖異生。(2)胰敏素通過(guò)抑制IRS-1的絲氨酸磷酸化,激活A(yù)kt/ERK磷酸化改善胰島素抵抗。第3章胰敏素對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠胰島素抵抗的改善作用目的：觀察胰敏素對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)小鼠對(duì)胰島素抵抗的改善作用。方法：(1)采用高脂飲食喂養(yǎng)小鼠,構(gòu)建胰島素抵抗小鼠模型。(2)利用HE染色及透射電鏡觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)變化,利用ELISA檢測(cè)肝臟糖原、G6P和PEPCK的含量與血液中胰島素、甘油三脂、游離脂肪酸和膽固醇的含量,利用qPCR檢測(cè)肝臟組織、肌肉組織及脂肪組織中糖異生相關(guān)基因SIRT1、PPARγ、PGC-1α、PGC-1β、FOXO1和G6P的mRNA表達(dá),利用Western blot檢測(cè)IRS-1、Akt、ERK、JNK及其磷酸化水平。結(jié)果：(1)成功構(gòu)建高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠模型。(2)胰敏素處理胰島素抵抗小鼠后能夠顯著減少血液中甘油三脂、膽固醇和脂肪酸的含量,但是不減少胰島素的含量；增加肝臟糖原,減少G6P和PEPCK的含量,增加SIRT1和PPARy的mRNA表達(dá),降低PGC-1α、 PEPCK、G6P和FOXO1的mRNA表達(dá),降低IRS-1的絲氨酸磷酸化水平,增加磷酸化Akt和ERK的表達(dá)。小結(jié)：(1)胰敏素可使高脂飲食小鼠肝臟、肌肉和脂肪組織中的糖異生減少及糖原生成增加。(2)胰敏素通過(guò)抑制高脂飲食小鼠肝臟、肌肉和脂肪組織中IRS-1的絲氨酸磷酸化,激活A(yù)kt/ERK磷酸化改善胰島素抵抗。結(jié)論：成功構(gòu)建的全新純?nèi)嗽葱灾亟M蛋白INSR-IgG4Fc(即胰敏素),并證實(shí)其通過(guò)抑制IRS-1絲氨酸磷酸化,促進(jìn)Akt/ERK磷酸化改善肝細(xì)胞及小鼠肝臟組織、肌肉組織、脂肪組織的胰島素抵抗。
[Abstract]:Insulin resistance is a major risk factor for diabetes mellitus ( T2DM ) and cardiovascular disease . A new recombinant protein , INSR - IgG1 Fc , was constructed and its mechanism was determined by means of SDS - PAGE . ( 2 ) The effect of glucagon on insulin resistance was studied by means of Western blot . ( 2 ) The expression of insulin , triglyceride , free fatty acids and cholesterol in liver , muscle and adipose tissue of liver , muscle and adipose tissue was detected by ELISA .

【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R587.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 張艷紅;楊偉;馮明;;抵抗素與胰島素抵抗、肥胖及2型糖尿病的關(guān)系[J];中國(guó)全科醫(yī)學(xué);2010年36期

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本文編號(hào)：1544802