本文關鍵詞： 鈉氫交換蛋白1 Akt 血管生成 糖尿病 心肌梗死 pH值 miR-29b 洛伐他汀 PA200 糖尿病 氧化應激 蛋白酶體　出處：《山東大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景與非糖尿病患者相比,糖尿病患者的心血管發(fā)病率和死亡率的風險顯著增高。糖尿病與血管閉塞后的不良預后相關,例如缺血性心臟病。血管生成對于心肌梗死(myocardial infarction,MI)之后重建對存活的心肌的血液供應是至關重要的,并且因此在心臟功能的恢復中起到重要作用。血管生成依賴于內(nèi)皮的細胞增殖,遷移和小管生成。然而,糖尿病損傷血管生成的分子機制仍然很大程度上未知。所有真核生物細胞內(nèi)液的pH值被稱為細胞內(nèi)pH(intracellularpH,pHi)值。pHi值的輕微變化,即使在生理范圍內(nèi),也可能改變細胞功能。在哺乳動物的細胞中,pHi值由膜蛋白鈉氫交換蛋白1(Na+/H+exchanger 1,NHE1)嚴格控制。NHE1通過交換細胞內(nèi)H+和細胞外Na+以增加pHi值。在病理刺激下,NHE1被激活,在心臟重塑時導致細胞內(nèi)堿化和細胞功能障礙。相比之下,我們和其他學者研究表明,細胞內(nèi)酸中毒(intracellularacidosis,IA)通過抑制NHE1改善糖尿病時的內(nèi)皮功能,并抑制血管肥厚和心肌病變,表明NHE1激活在糖尿病血管并發(fā)癥的重要作用。然而,NHE1激活是否在糖尿病損傷血管生成中起重要作用尚未完全了解。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,在血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和血管生成中調節(jié)細胞存活,增殖和代謝等多種基本功能。許多與血管內(nèi)皮生長因子相關的血管生成功能是通過細胞內(nèi)活化的Akt信號傳導通路介導的。在內(nèi)皮細胞中,與NHE1活化相似,Akt的失活也參與糖尿病時的內(nèi)皮功能障礙。因此,我們假設Akt活性可能與pHi值相關,并且高血糖可能通過激活NHE1以誘導細胞內(nèi)堿化,引起Akt失活。本研究旨在研究NHE1抑制或Akt激活在高糖(High Glucose,HG)損害內(nèi)皮功能中的作用和機制,然后探索NHE1,Akt和NHE1選擇性抑制劑cariporide在糖尿病小鼠心肌梗死后的血管生成和心功能恢復中的作用。研究目的:1.誘導HUVECs細胞內(nèi)酸化模型并研究Akt是否被IA激活2.檢測HG對HUVECs中NHE]活性和pHi值的影響3.研究抑制NHE1或過表達Akt能否逆轉HG損傷HUVECs的遷移能力和小管形成能力4.研究NHE1和Akt對糖尿病小鼠MI后血管新生和心功能恢復的影響5.研究NHE1抑制劑cariporide對糖尿病小鼠MI后血管新生和心功能的影響研究方法1.細胞培養(yǎng)及細胞內(nèi)酸化(IA)模型的建立人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)用內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基(ECM)進行培養(yǎng)。IA模型用NH4Cl溶液負載法進行誘導。首先,HUVECs用Tyrode緩沖液平衡90分鐘,然后用30mM NH 4 Cl溶液培養(yǎng)5分鐘。最后用含NHE]抑制劑cariporide的Tyrode緩沖液或不含Na+的Tyrode緩沖液代替NH4Cl溶液從而誘導IA模型。2.HUVECs 細胞轉染 SiRNA轉染NHESiRNA,研究NHE1對HUVECs小管形成和細胞遷移的影響。3.HUVECs細胞轉染慢病毒以攜帶Akt cDNA的慢病毒構建lenti-Akt,慢病毒在含2%FCS的無抗生素培養(yǎng)基中轉染過夜。Lenti-Akt轉染的目的是研究其對內(nèi)皮細胞小管形成和細胞遷移的影響。4.細胞內(nèi)pH值的測定通過使用pH敏感性熒光染料BCECF在測量HUVECs中pHi值。5.細胞內(nèi)NHE1活性測定在處理HUVEC后,通過使用測量 NH4Cl負載法誘導的IA后pHi恢復的初始速率來測定NHE1活性。6.體外小管形成實驗將HUVECs接種在用生長因子減少的Matrigel膠包被的細胞培養(yǎng)皿上,使用含或不含HG的培養(yǎng)基(含有0.5%FCS)培養(yǎng)。24小時后,通過顯微鏡拍攝照片。7.細胞遷移實驗應用劃痕試驗來檢測細胞的遷移。在將細胞接種到24孔板中后,用滅菌的槍頭在板底部的劃十字。分別拍攝零點,一天,兩天,三天,四天時劃傷的交叉點,計算細胞遷移數(shù),并計算遷移率。8.動物模型的建立將8-12周齡,20-25g的雄性野生型C57BL/6J小鼠飼養(yǎng)在溫度控制的籠中,并給予自由取水和正常食物。連續(xù)5天腹腔注射小劑量STZ(50mg/kg/day)用于誘導胰島細胞破壞和持續(xù)性高血糖。當 STZ注射2周后隨機血糖水平大于300 mg/dl時認定為高血糖。通過結扎冠狀動脈左前降支(LAD)建立小鼠心肌梗死模型。首先,用2%異氟烷麻醉小鼠。然后,在小鼠胸骨左緣第4肋間開胸,并輕輕地將心臟從胸腔中擠出.用6.0號無損傷線結扎冠狀動脈左前降支(LAD)。9.超聲心動圖檢測心臟功能MI手術后兩周,小鼠左側臥位進行標準的胸骨旁超聲。通過超聲心動圖系統(tǒng)計算收縮或舒張的左心室內(nèi)徑(LVID或LVIDd),射血分數(shù)(EF)和縮短分數(shù)(FS)。10.組織學染色將心臟組織石蠟包埋,切片(5μm)染白色。HE染色用于檢查梗死面積。免疫組織化學檢查α-SMA,NHE1,Akt,pAkt 和 endomucin。11.蛋白印跡(Western blot)從不同組的細胞和心臟組織提取蛋白質。通過Westernblot檢測pAkt,Akt,NHE1,PTEN,pGSK的表達水平。研究結果1.IA增加內(nèi)皮細胞中的Akt磷酸化在NH4Cl負載法誘導的細胞內(nèi)酸化模型中,Akt的磷酸化水平和活性明顯增加。2.HUVECs中的pHi值決定Akt磷酸化水平將HUVECs細胞置于含nigericin的不同PH值的高K+-HBS緩沖液30min,此時pHi值等于細胞外pH(pHe)值。與7.2-7.4的pHi值相比,低pHi值(6.4-7.0)增加細胞內(nèi)Akt的磷酸化。3.PI3K參與內(nèi)皮細胞中IA誘導的Akt激活PI3K抑制劑wortmannin在pHi值為6.4時顯著消除了細胞內(nèi)Akt磷酸化的升高,但在pHi值為7.4時不改變細胞中Akt磷酸化的水平,說明PI3K-PDK1信號傳導通路介導細胞內(nèi)酸化誘導的Akt磷酸化4.HG刺激HUVECs可激活NHE1并抑制Akt磷酸化HG刺激1小時后,NHE1活性明顯增加;而pHi值則在HG處理2小時后開始升高。但Akt磷酸化水平和活性在HG處理2小時后開始逐漸降低。5.HG經(jīng)NHE1抑制Akt的磷酸化HG刺激后細胞經(jīng)NHE1抑制劑cariporide處理后,Akt的磷酸化水平和活性并沒有降低,表明HG誘導的Akt失活是通過活化NHE1實現(xiàn)的。NHE1siRNA而非Control siRNA阻斷了高糖對Akt磷酸化的影響,進一步說明NHE1的活化在HG抑制Akt磷酸化中有著不可或缺的作用。6.HG通過NHE1激活和Akt抑制損傷HUVECs的小管形成能力HG刺激后,與NHE1 siRNA組相比,轉染Control siRNA的HUVECs小管形成明顯減少。Akt蛋白表達上調可促進HG干預后的小管形成。7.HG通過活化NHEI和抑制Akt損傷HUVECs的遷移能力HG可顯著抑制轉染Control siRNA或lenti-Vector慢病毒的HUVECs的遷移率,但對轉染NHE1 siRNA或轉染lenti-Akt慢病毒的HUVECs的遷移率無明顯影響。8.高血糖通過激活NHE1或抑制Akt減少小鼠MI后的血管生成α-SMA和endomucin的免疫組織化學結果顯示,NHE1缺失或Akt過表達的糖尿病小鼠梗死后心臟的毛細血管密度顯著增加。9.NHE1缺失或Akt過表達促進糖尿病小鼠MI后心臟功能的恢復超聲結果顯示,NHE1缺失或Akt過表達改善糖尿病小鼠梗死后心臟功能。1O.Cariporide促進糖尿病小鼠MI后的血管生成并改善心臟功能α-SMA和endomucin免疫組織化學的結果顯示,Cariporide增加了糖尿病小鼠缺血心臟中的毛細血管和小動脈密度,并且穩(wěn)定地降低心肌梗死后糖尿病小鼠的 LVIDs 和 LVIDd,升高 FS 和 EF。研究結論1.IA增加內(nèi)皮細胞中的Akt磷酸化;2.HG通過NHEI激活和Akt抑制損傷HUVECs的小管形成和遷移能力;3.NHE1缺失或Akt過表達促進糖尿病小鼠MI后血管生成和心臟功能的恢復;4.NHE1選擇性抑制劑Cariporide 可促進糖尿病小鼠MI后的血管生成并改善心臟功能。研究背景洛伐他汀可通過抑制HMG-CoA還原酶活性從而抑制HMG-CoA轉化為甲羥戊酸,因此被用來治療高膽固醇血癥。從膽固醇代謝過程來看,越來越多的證據(jù)表明,他汀類藥物對心血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)有潛在的益處。已有研究證明氧化應激可引起內(nèi)皮細胞功能紊亂,而后者是包括動脈粥樣硬化和高血壓在內(nèi)的心血管疾病的早期事件和標志。他汀類藥物通過抑制血管細胞氧化應激而阻止內(nèi)皮細胞功能紊亂的作用這一觀點已被廣泛接受。然而,他汀抑制CVD中氧化應激的作用靶點尚未完全闡明。一些先前的研究已證明CVD發(fā)生過程中,蛋白酶體激活與氧化應激以及隨后發(fā)生的內(nèi)皮細胞功能紊亂相關。在真核細胞中,蛋白酶體負責大多數(shù)目標蛋白的降解。蛋白酶體的功能受激動劑調節(jié),激動劑以單鏈或雙鏈的形式與20S核心催化亞基末端結合,并打開核心蛋白酶體的末端以使目標蛋白進入。作為蛋白酶體激動劑家族(proteasome activators,PAs)的一 員,PA200在哺乳動物組織中廣泛表達,并在DNA損傷過程中起重要作用。MicroRNA(miRs)是一種長約20個核苷酸的單鏈小分子RNA,通過與目標mRNA部分互補,抑制mRNA的降解或翻譯來調節(jié)基因表達。近日,AnnaS等學者報告,microRNA在蛋白酶體活性的調節(jié)過程中起重要作用。進一步研究表明,在骨髓瘤細胞中,miR-29b可通過作用于編碼PA200蛋白的PSME4基因抑制蛋白酶體�，F(xiàn)有數(shù)據(jù)表明,在成骨細胞、血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞中,他汀類藥物如洛伐他汀可通過抑制蛋白酶體活性來發(fā)揮其作用。因此,確定他汀類藥物在CVD中是否通過上調miR-29b抑制蛋白酶體活性是十分有意義的。在本實驗中,我們研究洛伐他汀如何調節(jié)PA200,并確定miR-29b在蛋白酶體激活中的作用。我們建立大鼠糖尿病和血脂異常模型,研究洛伐他汀和miR-29b在氧化應激介導的內(nèi)皮功能障礙中的作用機制。研究目的1.研究洛伐他汀對miR-29b表達的影響;2.研究洛伐他汀對蛋白酶體活性的影響及其機制;3.研究大鼠糖尿病和高血脂模型中,洛伐他汀和miR-29b在氧化應激介導的內(nèi)皮功能障礙中的作用機制。研究方法1.細胞培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)用內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基(ECM)進行培養(yǎng)。2.慢病毒載體的構建和轉染包含 scr-miR,anti-miR29b,pre-miR29b 和 PA200cDNA 的慢病毒由上海吉瑪公司構建。慢病毒在含有2%FBS的無抗生素培養(yǎng)基中轉染過夜。然后洗滌細胞并在新鮮培養(yǎng)基中再溫育12小時后,進行實驗。3.HUVECs 細胞轉染 SiRNAHUVECs用PA200的siRNA轉染以檢查其對洛伐他汀抑制蛋白酶體活性的作用。4.蛋白酶體活性的檢測通過用熒光酶標儀在380/460nm,37℃下檢測游離的7-酰胺基-4-甲基香豆素,連續(xù)監(jiān)測蛋白酶體活性。5.細胞和組織中ROS檢測通過DHE熒光和高效液相色譜兩種方法測定培養(yǎng)細胞中產(chǎn)生的ROS。將細胞與DHE(1OM)共培養(yǎng)30分鐘,PBS沖洗后用甲醇提取,高效液相色譜法采用C-18列來分離和量化氧代乙啶和溴化乙錠。O2-的產(chǎn)量取決于DHE和氧代乙啶之間的轉化。為了檢測動脈原位的ROS產(chǎn)量,分離大鼠頸動脈并將其立刻進行冰凍切片,用10MDHE染色30分鐘,沖洗后,用熒光顯微鏡觀察。6.RNA定量使用基于Trizol的RNA分離方案提取總RNA。RNA通過Nanodrop定量。使用Superscript Ⅱ RT Kit對每個RNA樣品進行cDNA合成,并使用Taqman PCR試劑進行實時定量聚合酶鏈反應。7.大鼠離體主動脈環(huán)制備通過靜脈注射戊巴比妥鈉(30mg/kg)在麻醉下處死大鼠。立即開胸取出降主動脈,仔細分離血管周圍結締組織,將主動脈切成3-4毫米長的薄片。8.糖尿病和高血脂模型的建立對SD大鼠連續(xù)5天腹腔注射小劑量STZ(50 mg/kg/day),損傷胰島細胞造成大鼠持續(xù)的高血糖,當血糖大于300 mg/dl時認定為糖尿病模型建立成功。用乙醚麻醉SD大鼠,自舌下靜脈注射LDL溶液(4 mg/kg)建立大鼠高血脂模型。9.丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的測量通過使用試劑盒推薦的方案測定主動脈組織或血清中MDA含量,SOD活性和GSH-Px活性。10.蛋白印跡(Western blot)從不同組的細胞和主動脈組織提取蛋白質。通過Westemblot檢測PA200的表達水平。研究結果1.洛伐他汀上調內(nèi)皮細胞中miR-29b表達內(nèi)皮細胞中洛伐他汀對miR-29b的上調作用具有時間依賴性和劑量依賴性。2.洛伐他汀可降低內(nèi)皮細胞中蛋白酶體活性通過特定濃度的洛伐他汀作用內(nèi)皮細胞一定時間,我們確定了洛伐他汀在體外對蛋白酶體活性的下調作用。3.miR-29b調控洛伐他汀抑制內(nèi)皮細胞蛋白酶體的活性在scr-miR組,洛伐他汀明顯降低蛋白酶體活性,但是在anti-miR-29b組則無該現(xiàn)象。在miR-29b過表達組,洛伐他汀對蛋白酶體活性的抑制作用進一步增強。4.PA200是洛伐他汀處理的內(nèi)皮細胞中miR-29b的作用靶點在轉染scr-miR慢病毒的內(nèi)皮細胞中,洛伐他汀顯著降低PA200蛋白水平。然而,轉染anti-miR-29b慢病毒組,洛伐他汀對PA200的下調作用消失;但pre-miR-29b慢病毒組,該作用顯著增強。5.洛伐他汀對蛋白酶體的活性抑制是PA200依賴性的在空白載體組,洛伐他汀顯著降低蛋白酶體活性;但是在PA200過表達組,該抑制作用消失。沉默PA200可消除洛伐他汀對蛋白酶體的抑制作用。6.阻斷miR-29b可消除洛伐他汀抑制高糖等多種心血管危險因素誘導的ROS生成通過檢測內(nèi)皮細胞內(nèi)DHE熒光密度,發(fā)現(xiàn)包括ox-LDL、H2O-2、TNF-α和HG在內(nèi)的多種心血管危險因素顯著增加細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)物,而洛伐他汀可消除這些異�，F(xiàn)象。在轉染scr-miR慢病毒的細胞內(nèi),洛伐他汀降低ox-LDL和HG誘導的活性氧產(chǎn)物,并且這些抑制作用在轉染anti-miR-29b慢病毒的細胞中消失。7.洛伐他汀在離體大鼠降主動脈環(huán)中減輕多種氧化劑誘導的內(nèi)皮功能障礙通過用ox-LDL的主要代謝產(chǎn)物LPC、外生自由基DPPH、內(nèi)源性活性氧H2O2與大鼠主動脈環(huán)孵育,發(fā)現(xiàn)這些氧化劑都損害乙酰膽堿引起的內(nèi)皮依賴性舒張。若用洛伐他汀預先處理主動脈環(huán),則可消除這些氧化劑引起的損害。8.洛伐他汀在體內(nèi)和體外均可改善HG引起的內(nèi)皮功能損害HG降低離體鼠主動脈環(huán)的乙酰膽堿依賴性血管舒張,而高滲刺激則無此作用。洛伐他汀處理使HG對血管舒張的抑制作用減弱,且該作用具有劑量依賴性。在注射STZ構建1型糖尿病大鼠模型中,高血糖引起的內(nèi)皮功能損害可被洛伐他汀改善,且具有劑量依賴性。此外,經(jīng)洛伐他汀干預后,糖尿病大鼠血液中升高的MDA水平、降低的SOD活性和GSH-Px都可恢復。9.洛伐他汀改善高血脂大鼠的內(nèi)皮功能損害在LDL注射前,分別用2mg/kg/d和4 mg/kg/d洛伐他汀預處理大鼠,可逆轉LDL引起的大鼠內(nèi)皮功能損害。此外,LDL引起的氧化應激,如SOD活性降低、血清MDA水平增加也被洛伐他汀治療逆轉。10.洛伐他汀減少糖尿病和高血脂模型大鼠體內(nèi)活性氧產(chǎn)物心血管疾病危險因素包括糖尿病和高血脂血癥,都顯著增加大鼠頸動脈的活性氧產(chǎn)物,洛伐他汀治療后可消除大鼠體內(nèi)的這些異常。研究結論1.洛伐他汀在內(nèi)皮細胞中可上調miR-29b表達和降低蛋白酶體活性;2.PA200是洛伐他汀處理的內(nèi)皮細胞中miR-29b的作用靶點;3.洛伐他汀通過抑制氧化應激反應預防糖尿病和高血脂血癥模型的大鼠內(nèi)皮功能障礙
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R587.1

【參考文獻】

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本文編號：1543786