本文關(guān)鍵詞： 氟 成骨細胞 鈣穩(wěn)態(tài) 鈣通道 鈣泵 硝苯地平　出處：《吉林大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的： 成骨活躍和骨轉(zhuǎn)換加速是形成氟骨癥多種骨骼改變的病理基礎(chǔ)，其中成骨細胞（osteoblast, OB）功能活躍在慢性氟中毒的骨損害中發(fā)生較早，是起著主導(dǎo)作用的環(huán)節(jié)，而OB Ca2＋濃度升高可能是氟激活OB的啟動機制之一。因此，研究氟作用條件下OB的Ca2+穩(wěn)態(tài)變化在氟中毒發(fā)生機制研究中非常必要。迄今有關(guān)這方面尚缺乏系統(tǒng)的研究，，OB內(nèi)Ca2+濃度升高在氟骨癥各種骨病變發(fā)生中的作用也還不十分清楚。本研究擬通過體內(nèi)、體外實驗，通過觀察氟作用下OB及大鼠骨組織L型鈣通道(Cav1.2)、鈣泵（PMCA，NCS）及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜IP3受體通道(IP3R)、鈣泵（SERCAs）變化，研究氟作用條件下OB Ca2+穩(wěn)態(tài)變化的機制；此外，將L型鈣通道特異性拮抗劑硝苯地平作為干預(yù)手段，從mRNA水平、蛋白水平檢測硝苯地平干預(yù)前后OB Cav1.2、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（c-fos, c-jun,runt-related transcription factor2(Runx2), osterix (OSX)）水平，從而闡明OB內(nèi)Ca2+升高在氟骨癥骨病變發(fā)生中的作用，同時探討L型鈣通道在氟作用下OB鈣穩(wěn)態(tài)維持中的角色，試圖為氟骨癥發(fā)生機制研究提供科學(xué)依據(jù)，為氟骨癥的防治策略提供新靶點、新思路、新方法。 方法： 不同濃度氟(0、2、5、10mg/L F-)處理OB細胞株（MC3T3-E1細胞）48小時，以及SD大鼠飲水?dāng)z氟(100mg/L F-)2個月，通過實時定量PCR和Western-Blot檢測細胞、大鼠骨組織Cav1.2、NCS、PMCA、IP3R、SERCA2b mRNA、蛋白表達水平，共聚焦顯微鏡檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度(intracellular free calcium ion，[Ca2+]i)。此外，將不同氟濃度條件液(0、2、5、10mg/L)及L型鈣通道拮抗劑硝苯地平(10μM)共同作用于MC3T3-E1細胞48小時，隨后通過實時定量PCR和Western-blot檢測Cav1.2，c-fos, c-jun, Runx2, OSX及共聚焦顯微鏡檢測[Ca2+]i。 結(jié)果： 1.通過觀察氟作用下OB細胞內(nèi)鈣離子濃度變化及質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上鈣通道、鈣泵的表達水平，我們發(fā)現(xiàn)： 1）氟作用下OB內(nèi)鈣離子濃度明顯升高，且呈濃度依賴性； 2）體外實驗結(jié)果示：低氟濃度下(F5組,特別是F2組)，OB Cav1.2、NCS-1mRNA和蛋白水平均明顯升高(P0.05)，IP3R mRNA和蛋白水平明顯降低(P0.05)，ATP2A2mRNA和蛋白水平降低(P0.05)；高氟濃度下(F10組)，OBCav1.2、NCS-1mRNA和蛋白水平均明顯減少(P0.05)，IP3R mRNA和蛋白水平降低(P0.05)，但較低氟作用下表達增多(P0.05)，ATP2A2mRNA和蛋白水平增加(P0.05)，SERCA2b mRNA水平亦明顯升高(P0.05)。換言之，與C組相比，F(xiàn)2組[Ca2+]i濃度、Cav1.2、NCS-1表達都增加，而IP3R和ATP2A2表達水平降低；F10組[Ca2+]i濃度、ATP2A2、SERCA2b表達增加，而Cav1.2、NCS-1和IP3R表達降低； 3）體內(nèi)實驗結(jié)果示：低氟濃度下(2組)，骨組織Cav1.2、NCS-1mRNA和蛋白水平均明顯升高(P0.05)，PMCA蛋白水平明顯升高(P0.05)，骨組織ATP2A2mRNA和蛋白水平降低(P0.05)；高氟濃度下(4組)，骨組織Cav1.2、NCS-1mRNA和蛋白水平均明顯減少(P0.05)，PMCA蛋白水平明顯減少(P0.01)，骨組織ATP2A2mRNA和蛋白水平增加(P0.05)。換言之，與體內(nèi)實驗1組相比，2組Cav1.2、NCS-1和PMCA表達都增加，而ATP2A2表達水平降低；4組Cav1.2、NCS-1和PMCA表達降低，而ATP2A2表達增加。 2.通過探討L型鈣通道在氟作用下OB鈣穩(wěn)態(tài)維持中的角色，結(jié)果顯示： 1）[Ca2+] i的水平以劑量依賴的方式隨著氟化物濃度的增加而增加； 2）低氟條件下，OB的Cav1.2mRNA和蛋白表達增加；高氟條件下，OB的Cav1.2mRNA和蛋白表達較少；加入硝苯地平后上述改變發(fā)生顯著變化； 3）低氟條件下，OB的轉(zhuǎn)錄因子c-fos和c-jun mRNA和蛋白表達增加；高氟條件下，OB的轉(zhuǎn)錄因子c-fos和c-jun mRNA和蛋白表達減少；加入硝苯地平后上述趨勢發(fā)生顯著變化； 4）低氟條件下，OB的Runx2和OSX mRNA和蛋白表達增加；高氟條件下，OB的Runx2和OSX mRNA和蛋白表達輕度升高或減少；加入硝苯地平后上述改變發(fā)生明顯變化。 結(jié)論： 1.氟作用下OB內(nèi)鈣離子濃度升高，且呈濃度依賴性； 2.在低氟濃度下，OB內(nèi)鈣離子增多主要由于細胞膜鈣離子通道開放所致，并通過質(zhì)膜上的鈣泵NCS、PMCA向胞外排放鈣離子以維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)； 3.在高氟濃度下，OB膜內(nèi)流及外排鈣離子減少，ER通過IP3R向胞內(nèi)排放鈣離子較低氟時增加，細胞內(nèi)超載的鈣離子主要通過ER膜上的鈣泵ATP2A2、SERCA2b從胞內(nèi)攝取鈣離子以維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)； 4.氟作用下的OB通過調(diào)節(jié)Cav1.2、NCS-1、PMCA、IP3R、SERCA2b/ATP2A2表達維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，質(zhì)膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣通道、鈣泵在氟作用下OB鈣穩(wěn)態(tài)變化中發(fā)揮重要作用； 5.低氟濃度（5mg/l，特別是2mg/l）下，OB Cav1.2、c-fos、c-jun、Runx2、OSX表達增加，成骨作用增強；而高氟濃度（102mg/l）下Cav1.2、c-fos、c-jun、Runx2、OSX表達相對減少，成骨作用相對減弱； 6.硝苯地平干預(yù)后，氟作用下OB [Ca2+] i的水平、Cav1.2、c-fos、c-jun、Runx2、OSX表達顯著改變，甚至發(fā)生逆轉(zhuǎn)； 7.氟通過L型鈣通道影響OB鈣穩(wěn)態(tài)及成骨轉(zhuǎn)錄因子的表達，使OB成骨功能活躍，從而啟動氟骨癥進程。
[Abstract]:Objective:
Active osteogenesis and bone turnover accelerated is the formation of pathological basis of skeletal fluorosis of various skeletal changes, including osteoblasts (osteoblast, OB) occurred earlier in the active function of bone damage in chronic fluorine poisoning, is plays a leading role in the link, OB and Ca2 + concentration may be one of the starting mechanism of fluoride activation of OB therefore, the change of OB Ca2+ steady state conditions in effect of fluoride fluoride poisoning on the mechanism is necessary. So far this is still a lack of systematic research, the concentration of Ca2+ in OB increased the role of changes in various bone diseases of skeletal fluorosis were not clear. This study by in vivo, in vitro experiments. By observing the effect of fluoride bone tissue and rat OB L type calcium channel (Cav1.2), calcium pump (PMCA, NCS) and the endoplasmic reticulum of IP3 receptor (IP3R), calcium pump (SERCAs) mechanism of OB Ca2+ steady state changes, changes of fluorine conditions; in addition, L Type calcium channel antagonist nifedipine as a means of intervention in the level of mRNA and protein levels before and after nifedipine intervention of OB Cav1.2, osteogenic transcription factor (c-fos, c-jun, runt-related transcription FACTOR2 (Runx2), osterix (OSX)), and clarify the elevation of OB Ca2+ in the occurrence of fluorosis of bone lesions. At the same time, to explore the role of L type calcium channel to maintain calcium homeostasis in OB under the action of fluoride in the attempt to provide a scientific basis for the pathogenesis of chronic fluorosis research for fluorosis prevention strategy to provide a new target, new ideas and new methods.
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本文編號：1523465