發(fā)布時(shí)間：2018-02-13 03:31

  本文關(guān)鍵詞： 糖尿病心肌病 心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞 Mst1 自噬　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(International Diabetes Federation,IDF)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,截止至2015年,在全球范圍內(nèi),糖尿病患者數(shù)量總計(jì)為4.15億人,糖尿病前期患者數(shù)量為3.18億人。根據(jù)目前每年增長的速度來預(yù)計(jì),如果不施以任何干預(yù)措施,至2040年,糖尿病患者數(shù)量總計(jì)將會達(dá)到6.42億人,而糖尿病前期人群數(shù)將達(dá)到4.81億人。近三十年來,我國糖尿病的患病率增加了17倍,從總?cè)丝跀?shù)的0.67%增長至11.6%。心血管(Cardiovascular,CV)并發(fā)癥在糖尿病患者的發(fā)病率和死亡率中占相當(dāng)大的比例。糖尿病心血管損傷的特點(diǎn)是內(nèi)皮功能發(fā)生障礙。內(nèi)皮是心血管系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分,它影響著微血管功能的許多方面,包括壓力、流量、滲透率、血管生成和血流變。糖尿病的血管內(nèi)皮發(fā)生功能障礙會導(dǎo)致微血管病的相應(yīng)臨床表現(xiàn)。然而,鮮為人知的是,與糖尿病相關(guān)的冠狀動脈微血管損傷的機(jī)制。因此,更好地了解糖尿病的發(fā)病機(jī)制和預(yù)防冠狀動脈微血管損傷是糖尿病管理中的核心問題。內(nèi)皮細(xì)胞作為葡萄糖和心肌細(xì)胞之間的屏障,在糖尿病相關(guān)的心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用。在最近的研究中,自噬成為心血管疾病治療的一個(gè)潛在的新靶點(diǎn),也有文獻(xiàn)證明了在防止糖尿病引起的腎小球硬化方面,內(nèi)皮細(xì)胞和足細(xì)胞的自噬作用。然而,目前還沒有研究表明心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬在糖尿病中的作用。Mst1(哺乳動物STE20樣激酶1)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,具有不同的生物功能,包括細(xì)胞自噬、凋亡和氧化應(yīng)激。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,在心肌梗死小鼠模型中,Mst1通過抑制自噬來促進(jìn)心臟功能障礙的發(fā)展。此外,我們的研究也表明,通過抑制Mst1基因能夠上調(diào)自噬,從而減輕梗死后心臟功能障礙。在心臟中,Mst1廣泛分布于心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。Mst1基因可以直接抑制Beclin1活性,然而,Mst1/Beclin1信號通路在糖尿病冠狀動脈微血管損傷發(fā)展的直接作用機(jī)制并不清楚。綜上所述,本研究分別從整體動物和細(xì)胞水平探討自噬在糖尿病心肌微血管損傷中的作用以及Mst1/Beclin1信號通路在其損傷中的作用,為糖尿病心肌病變的診治提供新的思路�！灸康摹�1.構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠糖尿病模型,分別觀察Mst1基因敲除和Mst1基因過表達(dá)的糖尿病小鼠心臟功能以及心肌微血管損傷情況。2.分離培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞,分別利用攜帶有Mst1 shRNA的腺病毒和Mst1的腺病毒干預(yù)細(xì)胞,觀察高糖條件下其對心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬水平的影響。3.明確自噬在糖尿病心肌微血管損傷中的作用,證實(shí)Mst1/Beclin1信號通路介導(dǎo)的自噬在高糖誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用�！狙芯糠椒ā�1.將C57和Mst1-/-小鼠隨機(jī)分為四組:正常C57小鼠組(WT),Mst1基因敲除小鼠組(Mst1-/-),糖尿病小鼠組(DM),糖尿病Mst1基因敲除小鼠組(DM+Mst1-/-)。2.將非轉(zhuǎn)基因小鼠和Mst1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為四組:非轉(zhuǎn)基因小鼠組(NTg),Mst1轉(zhuǎn)基因小鼠組(Tg-Mst1),糖尿病非轉(zhuǎn)基因小鼠組(DM+NTg),糖尿病Mst1轉(zhuǎn)基因小鼠組(DM+NTg)。3.按照50 mg/kg/d的標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建糖尿病小鼠模型,鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射。造模成功后,繼續(xù)飼養(yǎng)12周。4.于12周末,超聲檢測各組小鼠心臟功能;掃描電鏡觀察各組小鼠心肌微血管連接的完整性(血管鑄型實(shí)驗(yàn))。5.分離培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞,利用攜帶有Mst1 sh RNA(MOI:100)的腺病毒對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,隨機(jī)分為以下6組:A.對照組(5.5 mmol/L葡萄糖):Con;B.對照組(5.5 mmol/L葡萄糖):Con+Lac Z;C.Mst1下調(diào)組(5.5 mmol/L葡萄糖):Con+Ad-sh-Mst1;D.高糖對照組(33 mmol/L葡萄糖):HG;E.高糖對照組(33 mmol/L葡萄糖):HG+Lac Z;F.高糖Mst1下調(diào)組(33 mmol/L葡萄糖):HG+Ad-sh-Mst1。6.分離培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞,利用攜帶有Mst1(Ad-Mst1)(MOI:100)的腺病毒對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,隨機(jī)分為以下6組:A.對照組(5.5 mmol/L葡萄糖):Con;B.對照組(5.5 mmol/L葡萄糖):Con+Ad-Control;C.Mst1上調(diào)組(5.5 mmol/L葡萄糖):Con+Ad-Mst1;D.高糖對照組(33 mmol/L葡萄糖):HG;E.高糖對照組(33 mmol/L葡萄糖):HG+Ad-Control;F.高糖Mst1上調(diào)組(33 mmol/L葡萄糖):HG+Ad-Mst1。7.Western blotting法檢測腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的Mst1基因表達(dá)水平。8.心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中GFP-LC3的免疫熒光檢測。9.心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中p62/aggresome的免疫熒光檢測。10.透射電鏡觀察心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中自噬小體的形態(tài)及數(shù)量。11.TUNEL法檢測心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。12.JC-1染色檢測心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體膜電位水平。13.Western blotting法檢測心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中sirt1、Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和p62蛋白分子表達(dá)水平。【研究結(jié)果】1.Mst1基因敲除(Mst1-/-)能夠改善糖尿病小鼠的心功能障礙,能夠改善糖尿病小鼠心肌微血管內(nèi)皮連接的完整性。2.過表達(dá)Mst1基因能夠加重糖尿病小鼠的心臟功能障礙,能夠加重糖尿病小鼠心肌微血管內(nèi)皮連接完整性的破壞。3.Mst1基因敲除可以上調(diào)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬水平,降低p62/aggresome的聚集,促進(jìn)細(xì)胞自噬小體的生成,抑制高糖培養(yǎng)下心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,并且能夠改善心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體膜電位水平。4.過表達(dá)Mst1基因可以下調(diào)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中LC3的表達(dá),增加細(xì)胞中p62/aggresome的聚集,抑制細(xì)胞中自噬小體的生成,增加高糖培養(yǎng)下細(xì)胞的凋亡水平,并且能降低心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體膜電位水平。5.Western結(jié)果顯示:Mst1基因的下調(diào)可以使sirt1和Beclin1蛋白的表達(dá)顯著增多;可以促進(jìn)LC3-Ⅱ表達(dá),抑制p62表達(dá);可以引起自噬流的增強(qiáng),BAF中LC3-II/LC3-1比值增加,p62表達(dá)降低。6.Western結(jié)果顯示:Mst1基因的上調(diào)可以抑制sirt1和Beclin1蛋白的表達(dá);可以抑制LC3-Ⅱ表達(dá),促進(jìn)p62表達(dá);可以抑制自噬流,BAF中LC3-II/LC3-1比值減少,p62表達(dá)增多。【結(jié)論】通過本實(shí)驗(yàn),我們成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因小鼠糖尿病模型并分離培養(yǎng)出了小鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)了Mst1基因敲除能減輕糖尿病導(dǎo)致的心功能障礙,減輕心肌微血管的病理損傷,增加心肌的自噬水平;Mst1過表達(dá)可以加重糖尿病導(dǎo)致的心功能障礙,加重心肌微血管的病理損傷,降低心肌的自噬水平,其機(jī)制可能是通過Mst1/Beclin1信號通路發(fā)揮作用,為糖尿病心肌病變的診治提供新的思路。
[Abstract]:鏍規(guī)嵁鍥介檯緋栧翱鐥呰仈鐩，

本文編號：1507228