本文關(guān)鍵詞： 骨質(zhì)疏松 氧化應(yīng)激 自噬 骨細(xì)胞 骨質(zhì)疏松 氧化應(yīng)激 自噬 凋亡 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 骨質(zhì)疏松 BECN-1 自噬 增殖 凋亡 分化　出處：《上海交通大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分骨質(zhì)疏松骨組織中骨細(xì)胞自噬增加及其與氧化應(yīng)激和骨量的關(guān)系目的：探討骨質(zhì)疏松大鼠骨組織中骨細(xì)胞是否存在自噬,以及與氧化應(yīng)激的關(guān)系。方法：通過(guò)去卵巢建立骨質(zhì)疏松大鼠模型,將36只6周齡SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組,去卵巢組(Ovx組)和去卵巢加雌激素治療組(OVX+E2)。6周后,通過(guò)micro-CT和DEXA檢測(cè)骨微細(xì)結(jié)構(gòu)和骨量,透射電鏡觀察骨細(xì)胞胞漿內(nèi)自噬體以及細(xì)胞器的變化,免疫熒光法、Western blot和qRT-PCR檢測(cè)自噬特異性基因BECN-1、p62/SQSTM1以及Mapl-LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)。并通過(guò)ELISA檢測(cè)血漿內(nèi)雌激素水平、骨組織內(nèi)T-AOC、SOD、CAT等抗氧化酶活性。此外,分析自噬與氧化應(yīng)激的相關(guān)性。結(jié)果：骨質(zhì)疏松模型大鼠骨細(xì)胞,透射電鏡下細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)較多環(huán)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì),該物質(zhì)有自噬體特異性的雙層膜結(jié)構(gòu),同時(shí)Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)基因p62/SQSTM1、BECN-1以及Mapl-LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)增加。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示,骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型骨細(xì)胞胞漿內(nèi)Mapl-LC3蛋白的表達(dá)明顯增高；而骨組織內(nèi)抗氧化酶活性明顯下降,提示在此過(guò)程中細(xì)胞自噬與抗氧化酶相關(guān)。結(jié)論：骨質(zhì)疏松模型大鼠骨細(xì)胞自噬增強(qiáng),且與氧化應(yīng)激相關(guān),但自噬與氧化應(yīng)激的關(guān)系有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確。第二部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)自噬減輕成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷目的：氧化應(yīng)激誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡在骨質(zhì)疏松病理過(guò)程中起重要作用,但自噬在成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡中的作用尚未明確。本項(xiàng)研究的目的在于觀察自噬對(duì)成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用,并借此觀察細(xì)胞自噬與凋亡之間的關(guān)系。方法：給予不同濃度(0.1、1、10 mM)過(guò)氧化氫(H202)刺激Mc3T3-E1細(xì)胞；在不同時(shí)間(0、2、6、8、12h),采用透射電鏡觀察自噬體,MDC和LysoTracker染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的自噬溶酶體活性,Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白BECN-1、 Mapl-LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)變化,DCFH-DA熒光染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平；Annexin V/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；應(yīng)用Rap,3-MA和Baf-A1自噬調(diào)節(jié)劑觀察細(xì)胞內(nèi)的ROS水平,以明確自噬和凋亡之間的相互影響。Western blot檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)變化,包括p-PERK、PERK、IRE1、PDI、GRP-78蛋白表達(dá)變化。隨后應(yīng)用Talen技術(shù)敲除PERK、IRE1和GRP-78基因后,檢測(cè)細(xì)胞自噬變化,明確內(nèi)質(zhì)應(yīng)激與自噬的關(guān)系。最后,分別應(yīng)用GFP-LC3標(biāo)記自噬體,RFP標(biāo)記線粒體,免疫熒光定位在氧化應(yīng)激條件下Mc3T3-E1細(xì)胞線粒體和自噬體位置分布變化,以明確線粒體損傷與自噬的關(guān)系。結(jié)果：過(guò)氧化氫誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的凋亡和自噬,呈劑量和時(shí)間依賴性；自噬抑制劑(3-MA,Baf-A1)可顯著增強(qiáng)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平及凋亡率,Western blot證實(shí)cleaved Caspase-3和cleaved PARP蛋白增加；自噬誘導(dǎo)劑(Rap)部分抑制氧化氫誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和凋亡；氧化應(yīng)激誘導(dǎo)線粒體膜電位下降,線粒體細(xì)胞色素C等釋放增加。在過(guò)氧化氫處理2小時(shí)后,免疫熒光共定位顯示線粒體和自噬體的重疊度為23%。此外,過(guò)氧化氫誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)關(guān)鍵信號(hào)分子GRP-78或者PERK,導(dǎo)致細(xì)胞自噬受阻,凋亡增加。結(jié)論：通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑,自噬減輕成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激。自噬抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡,自噬是骨質(zhì)疏松治療潛在的靶點(diǎn)。第三部分BECN-1基因?qū)C3T3-E1成骨細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響目的：自噬抑制成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激,但具體機(jī)制尚不清楚。BECN-1是自噬關(guān)鍵調(diào)控基因,研究證實(shí)BECN-1在衰老,骨關(guān)節(jié)炎等退變性疾病過(guò)程中的發(fā)揮重要作用。然而,BECN-1在骨質(zhì)疏松和骨形成中的作用尚不清楚。本項(xiàng)研究的目的在于觀察BECN-1基因?qū)Τ晒羌?xì)胞增殖、分化和凋亡的影響。方法：應(yīng)用慢病毒(pGC-FU-3FLAG-BECN-1)和Talen技術(shù)分別構(gòu)建過(guò)表達(dá)和干擾BECN-1基因載體,建立BECN-1過(guò)表達(dá)和沉默細(xì)胞系；CCK-8檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖率；流式檢測(cè)BECN-1基因過(guò)表達(dá)和沉默對(duì)細(xì)胞周期影響；成骨誘導(dǎo)分化4周,茜素紅染色檢測(cè)成骨細(xì)胞礦化能力；成骨誘導(dǎo)分化48hrs,qRT-PCR和western blot檢測(cè)成骨分化相關(guān)Runx2、OCN、COL-1基因和蛋白的表達(dá)水平：最后,Annexin V-PE/7AAD染色流式細(xì)胞檢測(cè)BECN-1基因?qū)Τ晒羌?xì)胞凋亡的影響。結(jié)果：成功構(gòu)建穩(wěn)定BECN-1過(guò)表達(dá)和沉默的Mc3T3-E1細(xì)胞系；CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示：BECN-1基因沉默導(dǎo)致細(xì)胞增殖受抑制,但是BECN-1過(guò)表達(dá)細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯改變；流式檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示BECN-1過(guò)表達(dá)細(xì)胞無(wú)明顯變化,BECN-1基因沉默導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯于S期；成骨誘導(dǎo)分化4周,BECN-1基因沉默細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少,而B(niǎo)ECN-1過(guò)表達(dá)不影響細(xì)胞礦化能力；成骨誘導(dǎo)分化48 hrs,qRT-PCR和western blot檢測(cè)結(jié)果示BECN-1基因沉默抑制Runx2、OCN、COL-1基因和蛋白的表達(dá),而B(niǎo)ECN-1過(guò)表達(dá)對(duì)成骨分化相關(guān)基因表達(dá)影響不明顯。過(guò)氧化氫處理12 hrs,BECN-1基因沉默導(dǎo)致細(xì)胞更易受過(guò)氧化氫損傷,成骨細(xì)胞凋亡率升高,而B(niǎo)ECN-1過(guò)表達(dá)則抑制成骨細(xì)胞凋亡。結(jié)論：自噬基因BECN-1沉默導(dǎo)致成骨細(xì)胞增殖和分化受抑制,同時(shí)BECN-1基因沉默導(dǎo)致細(xì)胞更易受氧化應(yīng)激損害,凋亡增加。而B(niǎo)ECN-1過(guò)表達(dá)則增強(qiáng)成骨細(xì)胞抗氧化能力,凋亡減少。BECN-1可能是骨質(zhì)疏松抗氧化治療的有效靶點(diǎn)。
[Abstract]:The effects of autophagy on oxidative stress and oxidative stress in bone tissue were investigated by means of micro - CT and DEXA . The effects of BECN - 1 gene on proliferation , differentiation and apoptosis of MC3T3 - E1 cells were studied . The results showed that BECN - 1 gene silencing resulted in the inhibition of proliferation and differentiation of osteoblasts , but BECN - 1 overexpression did not affect cell mineralization .

【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R580

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