本文關(guān)鍵詞： 百草枯 肺纖維化 長(zhǎng)鏈非編碼RNA uc.77 2700086A05Rik A549　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的:1.選擇BALB/c小鼠,制造百草枯致肺纖維化疾病模型,以進(jìn)一步行實(shí)驗(yàn)研究。2.篩查lncRNA在纖維化肺組織中表達(dá)譜,篩選出與肺纖維化相關(guān)的lncRNA.3.研究lncRNA在肺纖維化中的作用,以為臨床研究及治療百草枯所致肺纖維化提供生物靶點(diǎn)。研究方法:(一)動(dòng)物造模1.應(yīng)用腹腔注射百草枯,制造百草枯中毒小鼠模型,根據(jù)病理切片及相關(guān)分析,建立肺纖維化小鼠模型。2.實(shí)驗(yàn)分組:本實(shí)驗(yàn)分為2組:正常對(duì)照組、百草枯造模組。3.小鼠肺纖維化模型的建立:以10mg/kg劑量,腹腔注射百草枯藥液,第一次記為Day 0,連續(xù)注射5次,每3日一次。在最后一次注射后6小時(shí)處死小鼠,取出標(biāo)本,以HE染色評(píng)價(jià)基本病理變化,以Masson染色評(píng)估纖維化情況,免疫組化法檢測(cè)纖維化特異性基因α-SMA表達(dá),熒光定量PCR檢測(cè)纖維化特異性基因表達(dá)。(二)芯片實(shí)驗(yàn)1.隨機(jī)抽取3對(duì)小鼠肺組織,送上�？党缮镉邢薰�,行l(wèi)ncRNA芯片分析。2.檢測(cè)纖維化肺組織及正常肺組織中差異表達(dá)的lncRNA:根據(jù)芯片提供結(jié)果,從眾多l(xiāng)ncRNA中篩選出差異表達(dá)的lncRNA。3.小鼠肺組織中驗(yàn)證芯片結(jié)果中差異表達(dá):數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索得出lncRNA序列,根據(jù)lncRNA序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物,采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法,檢測(cè)芯片結(jié)果中差異表達(dá)的lncRNA在肺組織中表達(dá)情況。4.數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)靶基因在纖維化肺組織中的驗(yàn)證:根據(jù)所選研究的lncRNA uc.77及2700086A05Rik,針對(duì)性地研究該lncRNA的預(yù)測(cè)靶基因ZEB2及HOXA3,采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法,檢測(cè)纖維化肺組織中上述靶基因mRNA表達(dá)情況。(三)過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)1.根據(jù)所選lncRNA,提交序列至上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司,以PEX-3質(zhì)粒為載體,合成uc.77及2700086A05Rik過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)完成后交付測(cè)序報(bào)告、對(duì)比圖譜、過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。2.常規(guī)培養(yǎng)人肺腺癌細(xì)胞(A549),以A549細(xì)胞作為研究對(duì)象,轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后,觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,熒光實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證過(guò)表達(dá)效率。3.過(guò)表達(dá)lncRNA后,采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法,檢測(cè)預(yù)測(cè)靶基因ZEB2及HOXA3 mRNA表達(dá)變化。4.過(guò)表達(dá)uc.77及2700086A05Rik后,檢測(cè)A549細(xì)胞功能學(xué)改變情況:采用采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法,檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志E-鈣黏蛋白、上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)、細(xì)胞角蛋白(KRT5),間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志波形蛋白(Vimentin)、α-肌動(dòng)蛋白(α-SMA),細(xì)胞外基質(zhì)標(biāo)志物MMP-2、MMP-9mRNA水平的表達(dá)變化。結(jié)果:(一)小鼠造模1.百草枯造模發(fā)病情況及體重變化:小鼠腹腔注射百草枯溶液后,小鼠活動(dòng)量及進(jìn)食量較前減少,呼吸急促,毛發(fā)光澤度變差,體重呈逐漸下降趨勢(shì),后期出現(xiàn)部分小鼠死亡。對(duì)照組小鼠正常生長(zhǎng),體重成正常增長(zhǎng)趨勢(shì),造模期間無(wú)死亡。2.組織病理學(xué)改變:HE染色顯示:顯微鏡下,百草枯模型的小鼠肺組織見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)在肺間質(zhì)中,間質(zhì)增厚,對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整清晰,未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。經(jīng)Masson染色后切片中,纖維組織可被染成明顯的藍(lán)色。光鏡下,百草枯組的小鼠肺組織纖維組織形成,被染成藍(lán)色的肺間質(zhì)增厚,對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整清晰,染色均勻,無(wú)明顯藍(lán)色沉積,肺泡壁厚度正常。3.免疫組織化學(xué)分析:免疫組化法檢測(cè)兩組小鼠肺組織中α-SMA蛋白表達(dá)情況,在正常對(duì)照組中,少見α-SMA蛋白表達(dá),在百草枯組中,可見多量α-SMA蛋白(褐色)表達(dá)。4.纖維化相關(guān)基因表達(dá):熒光定量PCR方法檢測(cè)E-cadherin,α-SMA,COL-1,COL-3,CTGF,MMP-3,Fibronectin 表達(dá),在造模組中 α-SMA,COL-1,COL-3,CTGF,MMP-3,Fibronectin 均表達(dá)上升,E-cadherin 表達(dá)下降。(二)lncRNA芯片結(jié)果分析:1.lncRNA差異表達(dá)分析:根據(jù)芯片結(jié)果,以差異倍數(shù)5倍且P0.05為篩選條件,篩選出顯著性差異表達(dá)的lncRNA及mRNA,相對(duì)于正常肺組織,在纖維化組織中表達(dá)上調(diào)和下調(diào)超過(guò)5倍的lncRNA分別有513種和204種。2.靶基因的基因本體論分析:靶基因進(jìn)行Gene Ontology分析示表達(dá)下調(diào)的lncRNA靶基因所參與的功能包括基因表達(dá)、調(diào)節(jié)凋亡、細(xì)胞分化、氣體轉(zhuǎn)運(yùn)、高分子代謝調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、肺部發(fā)育、氣道發(fā)育、呼吸系統(tǒng)發(fā)育、Rho蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)。下調(diào)的lncRNA靶基因所參與的功能包括細(xì)胞分化、組織發(fā)育、MAPKKK級(jí)聯(lián)、炎癥反應(yīng)、上皮細(xì)胞形態(tài)、損傷反應(yīng)、MAP激酶活性調(diào)節(jié)、上皮通道形態(tài)形成、肺形態(tài)發(fā)育。3.靶基因的KEGG Pathway分析:差異表達(dá)的lncRNA靶基因所參與的通路主要包括:細(xì)胞連接分子,過(guò)氧化物、藥物代謝酶細(xì)胞色素P450、哮喘、嘧啶代謝、P53信號(hào)通路、細(xì)胞縫隙連接、MAPK信號(hào)通路等。4.差異表達(dá)的lncRNA組織驗(yàn)證:在lncRNA基因芯片篩查肺纖維化相關(guān)lncRNA及其靶基因預(yù)測(cè)基礎(chǔ)上,選擇上調(diào)的lncRNA(AK052811,2700086A05Rik,uc.77,uc007mmq.1,uc008dzl.1,ENSMUST00000159621 and uc009ktt.l)以及下調(diào)的 lncRNA(ENSMUST00000121776,uc.455-,BC027568,ENSMUST00000065709,uc.456+,ENSMUST00000119054,and ENSMUST00000120952)作為研究對(duì)象,經(jīng)熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè),上述lncRNA均在肺組織中存在表達(dá)差異。5.預(yù)測(cè)靶基因的組織學(xué)驗(yàn)證:根據(jù)差異倍數(shù)5倍,對(duì)照組與纖維化組雙側(cè)本底表達(dá)量高,預(yù)測(cè)基因?yàn)槊鞔_參與肺纖維化的關(guān)鍵蛋白,基因組中位置相關(guān),種屬保守性高等條件,選取兩個(gè)lncRNA(uc.77及2700086A05Rik)作為研究對(duì)象,采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法,檢測(cè)兩組肺組織中,相應(yīng)預(yù)測(cè)靶基因ZEB2及HOXA3表達(dá)與對(duì)照組相比,均存在表達(dá)差異。(三)lncRNA功能學(xué)分析1.過(guò)表達(dá)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化:細(xì)胞形態(tài)由不規(guī)則橢圓形變?yōu)楠M長(zhǎng)形。2.過(guò)表達(dá)驗(yàn)證:對(duì)于轉(zhuǎn)染lncRNA后的A549細(xì)胞,提取總RNA,行逆轉(zhuǎn)錄后,經(jīng)熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)空白對(duì)照組及轉(zhuǎn)染組之間lncRNA表達(dá)水平差異,鑒定轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染lncRNA uc.77及2700086A05Rik后,其細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯高于空白組及陰性對(duì)照組。3.轉(zhuǎn)染lncRNAuc.77及2700086A05Rik后靶基因驗(yàn)證:根據(jù)靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示uc.77靶基因?yàn)閆EB2,2700086A05Rik靶基因?yàn)镠OXA3。在空白組、陰性對(duì)照組及轉(zhuǎn)染組間驗(yàn)證ZEB2、HOXA3 mRNA表達(dá)差異,可見轉(zhuǎn)染uc.77后,ZEB2基因的表達(dá)上升;轉(zhuǎn)染2700086A05Rik后,HOXA3的表達(dá)下降,表達(dá)差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.轉(zhuǎn)染后纖維化相關(guān)基因檢測(cè)(lncRNA功能學(xué)驗(yàn)證):驗(yàn)證上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin、EpCAM、KRT5;間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志 Vimentin、α-SMA;細(xì)胞外基質(zhì)標(biāo)志物 MMP-2、MMP-9。在轉(zhuǎn)染 uc.77 及 2700086A05Rik 后,E-cadherin、EpCAM、KRT5 表達(dá)下降,而 Vimentin、α-SMA、MMP-2、MMP-9 mRNA 表達(dá)上升。結(jié)論:1.經(jīng)腹腔注射百草枯藥液,可穩(wěn)定有效的制造出肺纖維化小鼠模型。2.多種lncRNA參與小鼠肺纖維化過(guò)程。多種差異表達(dá)的lncRNA的靶基因參與了肺纖維化過(guò)程。經(jīng)芯片檢測(cè)以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證,lncRNAuc.77及2700086A05Rik明顯高表達(dá)在纖維化小鼠肺組織中,且預(yù)測(cè)靶基因ZEB2和HOXA3與纖維化明顯。3.分別轉(zhuǎn)染lncRNAuc.77及2700086A05Rik至人A549細(xì)胞后,其靶基因ZEB2及HOXA3表達(dá)明顯變化,引起細(xì)胞形態(tài)改變,并促進(jìn)纖維化相關(guān)基因表達(dá)變化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R595.4;R-332

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