本文關(guān)鍵詞： XCT790 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 雌激素相關(guān)受體α 凋亡　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景與目的糖尿病患者中,有15%發(fā)生糖尿病足部潰瘍(Diabetic foot ulcers,DFUs),其危害大,常規(guī)治療療效不佳,世界各國醫(yī)學(xué)專家都在積極尋找到新的方法治療糖尿病周圍血管病變。近年來,自體干細(xì)胞移植療法治療缺血性疾病的療法逐漸得到肯定和重視。其中,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)來源豐富,體外擴(kuò)增安全性好,成為治療糖尿病下肢缺血的最佳選擇之一。但是,由于缺氧、缺營養(yǎng)、炎癥等因素的影響,干細(xì)胞移植后大量凋亡,成為制約其療效的關(guān)鍵問題。本課題組前期研究表明,過氧化物酶體增殖體激活受體γ輔活化因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α,PGC-1α)能激活MSCs的Bcl-2抗凋亡途徑,使MSCs耐受凋亡。但Bcl-2蛋白上游的調(diào)控機(jī)制還不甚清楚,有待進(jìn)一步研究。雌激素相關(guān)受體α(estrogen-related receptorα,ERRα)是世界上最早被發(fā)現(xiàn)的孤兒核受體之一,對能量代謝的活化起著重要作用,但鮮有文章研究ERRα在細(xì)胞凋亡途徑中的作用。課題組根據(jù)前期的研究和工作推測,PGC-1α有可能通過過氧化物酶增殖體激活受體γ(PPARγ)和/或ERRα這兩種核受體來實現(xiàn),因此本文選擇ERRα為突破口研究其與MSCs凋亡以及Bcl-2基因表達(dá)的聯(lián)系。我們利用ERRα的特異性拮抗劑XCT790拮抗ERRα,觀察MSCs在缺氧、缺營養(yǎng)、高葡萄糖條件下耐受凋亡能力是否下降,驗證ERRα與MSCs的凋亡是否相關(guān)。實驗方法與結(jié)果1.購買57BL/6小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞株,用誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)其分化為成脂和成骨細(xì)胞,油紅O染色和茜素紅染色結(jié)果為陽性。流式細(xì)胞儀檢測MSCs表面抗原標(biāo)記,Sca-1、CD44呈陽性,CD34、CD45為陰性。2.MSCs正常培養(yǎng)條件預(yù)實驗分為5組:1個空白對照組、4個不同濃度XCT790組(培養(yǎng)基中分別加入0.25%DMSO+0、5、10、20μmol/L XCT790),每組設(shè)3個復(fù)孔。都采用含10%FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)24 h上流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。結(jié)果顯示各組間凋亡率無顯著差異(P0.05)。3.MSCs凋亡誘導(dǎo)實驗的分為5組:1個正常培養(yǎng)對照組,在0.25%DMSO+10%FBS、正常氧分壓條件下培養(yǎng);4個不同濃度XCT790干預(yù)組(培養(yǎng)基中分別加入0.25%DMSO+0、5、10、20μmol/L XCT790)用3%O2、無FBS、葡萄糖濃度25 mmol/L的培養(yǎng)條件誘導(dǎo)MSCs凋亡,在12和24 h時檢測凋亡率。24 h時0、5、10及20μmol/L XCT790干預(yù)組凋亡率為24.60%±1.37%,32.73%±3.01%,42.64%±4.46%and61.35%±6.78%,5~20μmol/L干預(yù)組顯著高于0μmol/L干預(yù)組,且在5~20μmol/L內(nèi)呈劑量依賴性(P0.05,P0.01)。4.在MSCs誘導(dǎo)凋亡24h時,Real-Time PCR檢測Bcl-2、Bax基因和蛋白表達(dá)水平,5~20μmol/L XCT790干預(yù)組的Bcl-2 mRNA表達(dá)和Bcl-2/Bax比值顯著低于0μmol/L干預(yù)組(P0.05),且Bcl-2/Bax比值呈劑量依賴性(P0.05)。在24 h時檢測Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平,5~20μmol/L XCT790干預(yù)組的Bcl-2蛋白表達(dá)和Bcl-2/Bax比值顯著低于0μmol/L干預(yù)組(P0.05),而Bax蛋白表達(dá)顯著高于0μmol/L干預(yù)組(P0.05),Bcl-2/Bax比值呈劑量依賴性(P0.05)。結(jié)論1.本實驗采用的MSCs具有成骨、成脂分化的能力,表達(dá)Sca-1和CD44表面標(biāo)記,不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記CD34、CD45,符合小鼠MSCs的鑒定特征。2.正常培養(yǎng)條件下加入不同濃度XCT790,24 h內(nèi)MSCs凋亡率沒有明顯變化,提示在沒有誘導(dǎo)凋亡的因素存在時,拮抗ERRα并不導(dǎo)致MSCs凋亡。3.缺氧、缺營養(yǎng)及高糖條件下,拮抗ERRα可使MSCs凋亡率明顯升高,Bax蛋白表達(dá)增加,而Bcl-2基因和蛋白表達(dá)明顯下降,Bcl-2/Bax mRNA和蛋白比值明顯下降,提示ERRα可能通過Bcl-2蛋白途徑發(fā)揮抗凋亡作用。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 陸蘊(yùn)紅;李群益;陳莉;施孝金;;XCT790通過下調(diào)雌激素相關(guān)受體α的表達(dá)抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖[J];藥學(xué)學(xué)報;2014年02期

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本文編號：1476621