本文關(guān)鍵詞： microRNA-181a-5p Egr1 HK-2細(xì)胞 腎小管間質(zhì)纖維化 糖尿病腎病　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的和意義腎小管間質(zhì)纖維化(Tubulointerstitialfibrosis,TIF)在糖尿病腎病(Diabeteic nephropathy,DN)腎纖維化過程中扮演著十分重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1(early growth response factor 1,Egr1)在DN腎纖維化過程中發(fā)揮重要的作用,但潛在機(jī)制不明確,并且尚不明確Egr1在DN中是否調(diào)控TIF。微小RNA(microRNA,miRNA)作為一種轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)因子,通過與靶基因的3'端非翻譯區(qū)(untranslatedregion,UTR)的直接結(jié)合抑制靶基因的表達(dá)。研究證實(shí)在DN腎纖維化過程中,多種miRNA均發(fā)揮著十分重要的作用。但何種miRNA可以靶向調(diào)節(jié)Egr1的表達(dá)調(diào)控TIF尚不明確。本課題開展了體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)兩部分。旨在探討:1、在DN腎纖維化過程中,Egr1對(duì)TIF是否發(fā)揮作用。2、鎖定Egr1的上游調(diào)控因子miR-181a-5p。3、驗(yàn)證miR-181a-5p是否靶向抑制Egr1的表達(dá)延緩TIF。希望通過本研究為深入理解DN的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。研究方法1、選取雄性O(shè)LETF大鼠構(gòu)建DN動(dòng)物模型,LETO大鼠為對(duì)照組,PAS染色和Masson染色檢測(cè)40周齡大鼠腎臟的病理變化。免疫組化檢測(cè)大鼠腎組COL I mRNA和蛋白的表達(dá)。2、HK-2 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pENTER-Egr1 或 siEgr1,qRT-PCR 和 Western blot檢測(cè)Egr1、TGF-β1、FN和COL I mRNA和蛋白的表達(dá)。3、高糖及高滲培養(yǎng)液孵育HK-2細(xì)胞,qRT-PCR和Western blot檢測(cè)Egr1 mRNA和蛋白的表達(dá)。4、生物信息學(xué)網(wǎng)站篩選靶向調(diào)節(jié)Egr1的miRNA。高糖培養(yǎng)基孵育HK-2細(xì)胞,qRT-PCR檢測(cè)篩選出的miRNA,鎖定miR-181a-5p。qRT-PCR檢測(cè)大鼠腎組織miR-181a-5p mRNA。雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-181a-5p對(duì)Egr1的靶向調(diào)控作用。5、HK-2 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染 miR-181a-5p mimics 或inhibitor,qRT-PCR和 Western blot檢測(cè)Egr1、TGF-β1、FN和COL I mRNA和蛋白的表達(dá)。6、HK-2 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染 siEgr1、miR-181a-5p inhibitor 或 siEgr1+ miR-181a-5p inhibitor,qRT-PCR 和 Western blot 檢測(cè) Egr1、TGF-p1、FN 和 COL I mRNA 和蛋白的表達(dá)。結(jié)果1、40周齡的OLETF大鼠腎組織已經(jīng)呈現(xiàn)DN腎纖維化的病理特征,并且Egr1和TGF-β1表達(dá)明顯上調(diào),Egr1、TGF-β1、FN和COLImRNA及蛋白的表達(dá)均明顯增加。2、HK-2 細(xì)胞中,過表達(dá) Egr1 使 Egr1、TGF-β1、FN 和 COLImRNA 及蛋白表達(dá)均明顯上調(diào);沉默Egr1使Egr1、TGF-β1、FN和COL I mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào)。3、HK-2細(xì)胞中,高糖孵育使Egr1 mRNA及蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)時(shí)間依賴性變化的特點(diǎn)。高滲孵育使Egr1基因表達(dá)無明顯變化。4、生物信息學(xué)預(yù)測(cè)初步鎖定了 9個(gè)miRNAs。HK-2細(xì)胞中,高糖孵育使miR-181a-5p mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴性變化,且與Egr1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān);高滲孵育使miR-181a-5p mRNA表達(dá)無明顯變化。40周OLETF大鼠腎組織中miR-181a-5p mRNA表達(dá)明顯下降。雙熒光素酶報(bào)告基因顯示miR-181a-5p與Egr1 3'UTR靶向結(jié)合。5、HK-2 細(xì)胞中,過表達(dá) miR-181a-5p 使 Egr1、TGF-β1、FN 和 COL Ⅰ mRNA及蛋白表達(dá)均明顯下調(diào);沉默miR-181a-5p使Egr1、TGF-β1、FN和COL Ⅰ mRNA及蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)。6、HK-2 細(xì)胞中,共轉(zhuǎn)染 siEgr1+miR-181a-5p inhibitor 可以回復(fù)沉默 Egr1基因表達(dá)引起的Egr1、TGF-β1、FN和COL Ⅰ mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)。結(jié)論1、40周齡的OLETF大鼠腎組織呈現(xiàn)DN腎纖維化的病理特點(diǎn)。2、HK-2細(xì)胞中,Egr1通過上調(diào)TGF-β1增加ECM的合成。3、miR-181a-5p與Egr1 3'UTR靶向結(jié)合調(diào)控Egr1的表達(dá)。4、HK-2細(xì)胞中,miR-181a-5p通過抑制Egr1調(diào)控TGF-β1介導(dǎo)的纖維化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9

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本文編號(hào)：1468786