本文關(guān)鍵詞：胰島素抵抗狀態(tài)下Betatrophin基因的表達變化及對相關(guān)信號通路的影響　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： Betatrophin DNA 真核表達載體 Betatrophin 胰島素抵抗 RT-PCR Betatrophin 過表達 干擾 P-Ins R P-AKT

【摘要】：第一部分小鼠Betatrophin基因表達載體構(gòu)建及鑒定目的:構(gòu)建小鼠Betatrophin基因重組質(zhì)粒(p IRES2-EGFP-Betatrophin),并用于C57 BL/6J小鼠的原代肝細胞轉(zhuǎn)染。方法:提取小鼠肝臟組織Total RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)獲得c DNA。后續(xù)PCR擴增得到Betatrophin CDS序列全長。經(jīng)雙酶切,連接到真核表達載體p IRES2-EGFP上,構(gòu)建成p IRES2-EGFP-Betatrophin,后續(xù)通過雙酶切+凝膠電泳、DNA測序、Blast對重組質(zhì)粒進行鑒定。結(jié)果:將重組質(zhì)粒(p IRES2-EGFP-Betatrophin)和經(jīng)過雙酶切的重組質(zhì)粒進行瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像后前者(p IRES2-EGFP-Betatrophin重組質(zhì)粒)出現(xiàn)在對應(yīng)Marker 5897bp的位置;后者出現(xiàn)兩條線性化條帶,分別在對應(yīng)Marker 597bp(Betatrophin CDS全長序列)位置和5.3kb(p IRES2-EGFP線性條帶)位置,初步確定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。測序結(jié)果同Genbank中Betatrophin m RNA所編碼的CDS序列全長在NCBI中進行DNA序列比對,比對結(jié)果完全一致,證明所克隆的基因就是小鼠Betatrophin c DNA。結(jié)論:成功構(gòu)建真核表達載體p IRES2-EGFP-Betatrophin。第二部分Betatrophin在小鼠組織中的表達目的:探索普食、高脂喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠組織中,Betatrophin m RNA和蛋白表達差異。方法:取高脂飼料喂養(yǎng)(HFD)28周的C57BL/6J小鼠(5只)、普食喂養(yǎng)(SD)的同齡C57BL/6J小鼠(5只)處死取肝臟、脂肪組織于液氮中保存,后續(xù)提取各對應(yīng)組織RNA并逆轉(zhuǎn)錄為c DNA,再通過實時定量熒光PCR測定Betatrophin的m RNA表達差異;提取各對應(yīng)組織總蛋白,通過Western blot方法測定Betatrophin的蛋白表達差異。結(jié)果:Betatrophin mRNA和蛋白表達量在HFD小鼠的肝臟和脂肪組織中明顯高于(p0.05或p0.01)SD小鼠對應(yīng)組織;結(jié)論:提示,Betatrophin的表達可能與小鼠機體的胰島素抵抗相關(guān)。第三部分Betatrophin在肝細胞中的表達及其對胰島素信號通路的影響目的:探索胰島素抵抗狀態(tài)的小鼠肝原代細胞Betatrophin基因表達情況,以及Betatrophin過表達對增加小鼠肝細胞胰島素抵抗的機制。方法:分離C57BL/6J小鼠原代肝細胞,分組培養(yǎng)。使用濃度遞增的胰島素處理;經(jīng)一定濃度胰島素處理24h的原代肝細胞再通過羅格列酮或者二甲雙胍作用,通過定量PCR及Western blot檢測Betatrophin表達。原代肝細胞和巨噬細胞RAW264.7共培養(yǎng);另外組使用羅格列酮或者二甲雙胍處理共培養(yǎng)體系細胞,通過定量PCR及Western blot檢測Betatrophin表達情況;另外各組原代肝細胞分別加2%(在培養(yǎng)基中所占體積比)的PBS(空白對照)、正常人血清(normal)、PCOS患者未治療者血清(Before metformin)、PCOS患者二甲雙胍治療3個月血清(3months after metformin)、PCOS患者二甲雙胍治療6個月的血清(6months after metformin)培養(yǎng)24小時,再通過定量PCR及Western blot檢測Betatrophin、P-Ins R以及P-AKT表達;最后用過表達質(zhì)粒以及干擾RNA轉(zhuǎn)染小鼠肝原代細胞48h,定量PCR以及Western blot檢測Betatrophin、P-Ins R以及P-AKT表達情況。結(jié)果:隨著insulin濃度梯度的增加,insulin處理的肝原代Betatrophin表達逐漸增高(p0.05或p0.01),同時經(jīng)一定濃度insulin作用24h的肝原代細胞再用不同濃度羅格列酮或者二甲雙胍處理后Betatrophin表達顯著下降(p0.05或p0.01);肝原代細胞、巨噬細胞264.7共培養(yǎng)體系在經(jīng)羅格列酮或者二甲雙胍作用后Betatrophin表達顯著降低(p0.05或p0.01);Betatrophin過表達組的P-Ins R、P-AKT表達同對照組比明顯降低(p0.01),Betatrophin干擾組的P-Ins R、P-AKT表達相對于對照組顯著升高(p0.01)。結(jié)論:Betatrophin表達與胰島素抵抗相關(guān),Betatrophin基因過表達可能抑制了PI3K/Akt信號通路,降低胰島素敏感性,從而增強肝細胞胰島素抵抗。
[Abstract]:The first part of the expression of Betatrophin gene in construction and identification of recombinant vector Objective: to construct the recombinant plasmid of mouse Betatrophin gene (P IRES2-EGFP-Betatrophin), and for primary liver cells transfected with C57 BL/6J mice. Methods: the extraction of liver tissue of mice Total RNA by reverse transcription (RT-PCR) C DNA. PCR further amplified the full-length CDS sequence of Betatrophin. After double enzyme cut, connected to the eukaryotic expression vector p IRES2-EGFP, construct P IRES2-EGFP-Betatrophin, following by double enzyme digestion and gel electrophoresis, DNA Blast sequencing, the recombinant plasmids were identified. Results: the recombinant plasmids (P and IRES2-EGFP-Betatrophin) after double digestion of recombinant plasmid was analyzed by agarose gel electrophoresis, gel imaging (after the former p the recombinant plasmid of IRES2-EGFP-Betatrophin Marker 5897bp) appears in the corresponding position; two linear bands which appeared respectively in the corresponding Marker 597bp (Betat The full-length sequence of rophin CDS 5.3kb (P) position and IRES2-EGFP linear belt) position, preliminary determination of the recombinant plasmid was constructed successfully. The sequencing results with CDS Betatrophin m RNA sequence is Genbank encoding in NCBI DNA sequences alignment result is completely consistent, which indicated that the cloned gene is mouse Betatrophin C DNA. conclusion: really the expression vector p IRES2-EGFP-Betatrophin. second Betatrophin in mice Objective: To explore the successful construction of normal diet, high-fat diet C57BL/6J mice, Betatrophin m RNA and protein expression differences. Methods: high fat diet (HFD) for 28 weeks C57BL/6J mice (5 rats), normal chow (SD) age C57BL/6J mice (n = 5) were sacrificed and the liver, adipose tissue stored in liquid nitrogen, the subsequent extraction of corresponding tissue RNA and reverse transcription of C DNA, then Betatrophin PCR real time fluorescence quantitative determination The m RNA expression; protein extraction of the corresponding tissue, expression determination of Betatrophin protein by Western blot method. Results: the expression of Betatrophin and mRNA protein in HFD mouse liver and adipose tissue was significantly higher than that of (P0.05 or P0.01) corresponding to SD mice; conclusion: the results suggest that, relative expression of Betatrophin may be related to mice insulin resistance in the body. The third part of the Betatrophin expression in liver cells and its effect on the insulin signaling pathway Objective: To explore the insulin resistance state of mouse liver primary cells the expression of Betatrophin gene, and Betatrophin overexpression on insulin resistance increase mechanism of liver cells in mice. Methods: primary cultured hepatic cells of C57BL/6J mouse. The use of insulin treatment. The increasing of the concentration of the primary hepatocytes; 24h treatment of insulin by rosiglitazone or a two Double guanidine, PCR and Western blot by quantitative detection of Betatrophin expression in primary hepatocytes and macrophages. RAW264.7 co cultured with rosiglitazone or metformin group; another treatment co culture system of cells, the expression of PCR and Western by quantitative detection of blot Betatrophin in each group; primary hepatocytes were 2% (in volume ratio based training in) PBS (blank control), normal human serum (normal), PCOS in patients with untreated serum (Before metformin), metformin in patients treated with PCOS for 3 months (3months after metformin) in serum, serum of metformin in patients treated with PCOS for 6 months (6months after metformin) for 24 hours, and then through the quantitative PCR and Western blot detection of Betatrophin, expression of P-Ins R and P-AKT; finally used the expression plasmid and interference RNA transfection of mouse primary hepatocytes 48h, PCR and Western blot quantitative detection of Betatroph In, P-Ins R and P-AKT expression. Results: with the increase of insulin concentration gradient, insulin treatment of primary liver Betatrophin expression gradually increased (P0.05 or P0.01), and the primary function of a certain concentration of insulin 24h in hepatic cells with different concentrations of rosiglitazone or metformin two Betatrophin after treatment was significantly decreased (P0.05 or P0.01); primary liver cell, macrophage co culture system in 264.7 by rosiglitazone or metformin significantly decreased expression of Betatrophin (P0.05 or P0.01); Betatrophin group of P-Ins R expression, P-AKT expression decreased significantly compared with the control group (P0.01), Betatrophin P-Ins R P-AKT interference group, the expression was significantly increased compared with the control group (P0.01). Conclusion: the expression of Betatrophin is associated with insulin resistance, overexpression of Betatrophin could inhibit the PI3K/Akt signaling pathway, reduced insulin sensitivity, thereby enhancing the Insulin resistance in liver cells.

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.1

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 傅誠強;胰島素抵抗和擇期性手術(shù)[J];國外醫(yī)學(xué).外科學(xué)分冊;2001年03期

2 賈偉平;中國人群胰島素抵抗的狀況[J];國外醫(yī)學(xué).內(nèi)分泌學(xué)分冊;2002年04期

3 寧光;李長貴;洪潔;湯正義;李果;龔艷春;彭怡文;郭冀珍;沈衛(wèi)峰;商淑華;羅邦堯;陳家倫;;胰島素抵抗基礎(chǔ)和臨床研究[J];醫(yī)學(xué)研究通訊;2002年11期

4 姚小皓,沈凱,李學(xué)軍;胰島素對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的影響[J];生理科學(xué)進展;2003年01期

5 柯紅林;;2型糖尿病中胰島素抵抗發(fā)生機制的研究進展[J];國外醫(yī)學(xué)(老年醫(yī)學(xué)分冊);2003年03期

6 常桂娟;胰島素抵抗的環(huán)境因素[J];現(xiàn)代診斷與治療;2004年02期

7 米杰 ,張力;胰島素抵抗[J];中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2004年04期

8 王繼旺,張素華,任偉,杜娟,陳靜,包柄楠,汪志紅,苗青;吸煙與胰島素抵抗的相關(guān)性調(diào)查與分析[J];中國公共衛(wèi)生;2004年08期

9 陽柳雪;劉紅;;可溶性腫瘤壞死因子受體2與胰島素抵抗[J];中國醫(yī)學(xué)文摘.內(nèi)科學(xué);2004年01期

10 康艷明;陽躍忠;;胰島素抵抗與缺血性心腦血管病變[J];中國醫(yī)學(xué)文摘.內(nèi)科學(xué);2004年02期

相關(guān)會議論文 前10條

1 陳艷秋;宗敏;華莉;李臻;肖菲;孫建琴;;2型糖尿病患者肝臟脂肪與胰島素抵抗的關(guān)系[A];中國營養(yǎng)學(xué)會老年營養(yǎng)分會第七次全國營養(yǎng)學(xué)術(shù)交流會“營養(yǎng)與成功老齡化”暨國家級繼續(xù)教育項目“神經(jīng)系統(tǒng)疾病醫(yī)學(xué)營養(yǎng)治療”資料匯編[C];2010年

2 陳艷秋;陳敏;宗敏;華莉;李臻;張鑫毅;孫建琴;;2型糖尿病患者肝臟脂肪分布與胰島素抵抗[A];老年營養(yǎng)研究進展與老年營養(yǎng)供餐規(guī)范研討會暨糖尿病腎病醫(yī)學(xué)營養(yǎng)治療進展學(xué)習(xí)班資料匯編[C];2011年

3 宋曉敏;耿秀琴;郭長磊;;胰島素抵抗幾個相關(guān)因素在公安人群中的狀態(tài)與分析[A];中華醫(yī)學(xué)會第六次全國內(nèi)分泌學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2001年

4 游捷;陳瑤;黃培基;林哲章;;血清可溶性腫瘤壞死因子受體與胰島素抵抗的關(guān)系[A];中華醫(yī)學(xué)會第六次全國內(nèi)分泌學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2001年

5 謝彬;陳上云;郭堅;劉薇;勞干誠;;監(jiān)測真胰島素觀察胰島素抵抗與胰島素敏感性[A];中華醫(yī)學(xué)會第六次全國內(nèi)分泌學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2001年

6 尹義輝;王經(jīng)武;;消胰抗治療胰島素抵抗的臨床研究[A];第七次全國中醫(yī)糖尿病學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2003年

7 呂圭源;劉賽月;;中藥抗胰島素抵抗研究進展[A];浙江省2005年中藥學(xué)術(shù)年會論文集[C];2005年

8 王曉靜;劉正齊;;一種簡便實用且較準確評估胰島素抵抗的新方法[A];全國中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)分泌代謝病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

9 白秀平;李宏亮;楊文英;肖建中;王冰;杜瑞琴;樓大鈞;;脂肪分存順序與肝臟及肌肉胰島素抵抗的關(guān)系[A];2006年中華醫(yī)學(xué)會糖尿病分會第十次全國糖尿病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2006年

10 孫勤;李伶;楊剛毅;歐陽凌云;陳渝;劉華;唐毅;Gunther Boden;;小鼠擴展胰島素鉗夾術(shù)的建立[A];2006年中華醫(yī)學(xué)會糖尿病分會第十次全國糖尿病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2006年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 ;胰島素小常識[N];保健時報;2004年

2 ;胰島素抵抗，，怎么辦？[N];解放日報;2004年

3 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院老年病科副教授 陳化;什么是“胰島素抵抗”[N];健康報;2001年

4 張家慶 （教授）;適度鍛煉身體改善胰島素抵抗[N];上海中醫(yī)藥報;2003年

5 本報記者 韓曉英;注射胰島素會成癮嗎[N];中國中醫(yī)藥報;2002年

6 張怡梅 劉 斌;惡性腫瘤與胰島素抵抗[N];中國中醫(yī)藥報;2003年

7 健康時報特約記者 陳錦屏;胖人易發(fā)“胰島素抵抗”[N];健康時報;2007年

8 殳雪怡;胰島素抵抗 有辦法“抵抗”嗎[N];家庭醫(yī)生報;2007年

9 劉文山;胰島素抵抗[N];家庭醫(yī)生報;2007年

10 孟懷東;“致命四重奏”與胰島素抵抗[N];中國醫(yī)藥報;2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 殷青青;胰島素抵抗大鼠腦組織損傷機制以及番茄紅素的保護作用研究[D];山東大學(xué);2015年

2 施琳穎;二氫楊梅素通過誘導(dǎo)細胞自噬改善骨骼肌胰島素抵抗的作用及其機制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

3 隆敏;下丘腦室旁核神經(jīng)肽Y長期過表達誘導(dǎo)外周胰島素抵抗作用機制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

4 黃文輝;高胰島素抑制腎臟尿酸排泄的基礎(chǔ)與臨床研究以及氯沙坦的干預(yù)機制[D];蘭州大學(xué);2015年

5 付鋒;缺血后心肌胰島素抵抗促發(fā)缺血性心力衰竭及其機制[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

6 王宗保;NO-1886對糖脂代謝的影響及機制研究[D];南華大學(xué);2014年

7 張真穩(wěn);小檗堿協(xié)同甘丙肽降低2型糖尿病鼠脂肪組織胰島素抵抗的實驗研究[D];揚州大學(xué);2015年

8 汪心安;IRF9對小鼠非酒精性脂肪肝和胰島素抵抗的調(diào)控作用及機制研究[D];武漢大學(xué);2013年

9 鄭濤;紅景天苷改善胰島素抵抗的作用及其機制[D];華中科技大學(xué);2015年

10 陳茜;Betatrophin與胰島素抵抗的相關(guān)性及機制研究[D];華中科技大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李晨;辛伐他汀、胰島素聯(lián)合用藥對糖尿病大鼠下頜骨骨折愈合的影響[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

2 賈曉嬌;血清Vaspin、u樗�、脂联素灾R焉鍰悄蠆』頰咧興郊壩胍鵲核氐摯溝墓叵礫D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

3 黃聲;胰島素抵抗與認知功能障礙的關(guān)系研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

4 牛尚梅;骨骼肌PGC-1α在高脂導(dǎo)致的胰島素抵抗中的作用機制[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

5 安雨;血清視黃醇結(jié)合蛋白-4與2型糖尿病及肥胖的相關(guān)性研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

6 陳旭;高胰島素水平導(dǎo)致肥胖相關(guān)機制研究[D];鄭州大學(xué);2015年

7 劉晨曦;津力達改善棕櫚酸誘導(dǎo)的肌細胞胰島素抵抗的機制[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

8 段力園;津力達顆粒對高脂誘導(dǎo)的HepG2細胞胰島素抵抗影響的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

9 張東蛟;津力達對高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗ApoE基因敲除小鼠脂肪組織中脂代謝的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

10 李貴平;黃芪甲苷對高胰島素誘導(dǎo)人腎小球系膜細胞損傷的保護作用及機制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

本文編號：1390696