本文關鍵詞：Indian Hedgehog信號通路相關因子在氟中毒大鼠軟骨組織及軟骨細胞中的表達及其意義

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【摘要】：目的通過檢測慢性氟中毒大鼠軟骨組織及其軟骨細胞中Ihh、Smo、PTHrp蛋白與mRNA表達水平變化,探討Indian hedgehog(Ihh)信號通路在慢性氟中毒體內及體外的作用與機制。方法1、建立動物染氟模型,SD大鼠36只,按體重隨機分為3組,每組12只,對照組:氟離子濃度1 mg/L、低氟中毒組:NaF濃度5 mg/L、高氟中毒組:NaF濃度50 mg/L。飼養(yǎng)6個月后應用氟離子選擇電極法測定尿氟,股骨骨氟,蘇木素-伊紅(Hematoxylin and Eosin,HE)染色后光鏡下觀察軟骨組織形態(tài)學病理改變;免疫組織化學(Immunohistochemistry,IHC)PV-6001法檢測大鼠關節(jié)軟骨組織中Ihh、Smo、PTHrp蛋白以及凋亡調控蛋白Bcl-2、Bax和增殖調控蛋白Cyclin D1、PCNA表達情況。2、建立細胞染氟模型,原代培養(yǎng)乳鼠關節(jié)軟骨細胞,傳第3代后按染氟濃度不同分為0(對照)、5、10、20、40 mg/L組,噻唑藍(MTT)、流式細胞術分別檢測各組細胞增殖、凋亡的變化。蛋白印跡(Western Blot)和逆轉錄PCR(RT-PCR)檢測各組染氟48 h后Ihh信號通路中Ihh、Smo、PTHrp的蛋白及其mRNA表達含量。結果1、慢性氟中毒大鼠模型建立成功。與對照組(1.73±0.07、1.95±0.06)相比,低、高氟組大鼠尿氟、骨氟含量(2.34±0.21、4.33±0.46;98.81±9.03、131.52±9.14)逐漸升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);2、光鏡觀察發(fā)現(xiàn),隨著染氟劑量增加,低、高氟組較對照組關節(jié)軟骨組織明顯變薄且排列紊亂,部分細胞有變性。3、大鼠軟骨組織免疫組化與Western blot結果顯示,與對照組相比,低、高氟組Ihh、Smo、PTHrp、Bax蛋白表達逐漸升高,而低、高氟組Bcl-2、Cyclin D1、PCNA蛋白表達降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4、成功獲得了性狀和表型一致的大鼠軟骨細胞,MTT結果顯示,與對照組比較,各時間段5 mg/L染氟組細胞增殖率[1.10±0.08、1.13±0.08、1.15±0.08比1.17±0.07、1.20±0.06、1.16±0.08]明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),40 mg/L染氟組細胞48h、72h增殖活性[0.72±0.11、0.68±0.04]則顯著降低(P0.05)。流式檢測結果表明,與對照組相比較,24、48、72 h時40 mg/L染氟組軟骨細胞凋亡率逐漸增高[(19.87±3.03)%、(25.30±1.28)%、(45.73±4.63)%]差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5、與對照組相比,培養(yǎng)48 h后Ihh、Smo、PTHrp的蛋白及其mRNA表達在染氟各組(Ihh蛋白:0.77±0.08比0.98±0.07、1.23±0.06、1.37±0.07、1.34±0.07;PTHrp蛋白:0.68±0.04比0.89±0.05、0.83±0.05、1.29±0.05、1.16±0.08;Smo蛋白:0.37±0.01比0.64±0.06、0.67±0.03、0.96±0.06、0.69±0.06,Ihh mRNA:0.77±0.05比0.98±0.05、1.09±0.05、1.27±0.03、1.46±0.06;PTHrp mRNA:0.67±0.07比0.97±0.05、1.07±0.08、1.37±0.05、1.45±0.05;Smo mRNA:0.45±0.03比0.63±0.04、0.71±0.05、0.81±0.01、1.00±0.02)均高于對照組(P0.05)。結論1、過量氟可導致關節(jié)軟骨組織損傷;同時,低劑量的氟可促進軟骨細胞增殖,而高劑量氟會導致軟骨細胞凋亡。2、過量氟可刺激軟骨組織及軟骨細胞中Ihh、Smo、PTHrp的蛋白及其mRNA表達升高,證明體內及體外均存在Ihh信號通路表達,并受氟劑量的增多而升高。提示氟上調軟骨中Ihh信號通路相關因子以及促進軟骨細胞的增殖與凋亡可能共同參與軟骨的損傷過程。
【學位授予單位】：貴州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R599.1

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