本文關(guān)鍵詞：1型糖尿病大鼠Nfic與成骨成脂相關(guān)基因表達(dá)的探究及胰島素的干預(yù)作用

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【摘要】：糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。機(jī)體血糖增高是由于胰島素分泌缺陷、生物作用受損或兩者協(xié)同作用所致。血糖水平增高可導(dǎo)致機(jī)體各種組織,特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害與功能障礙。1型糖尿病(DM1)多發(fā)于兒童和青少年,表現(xiàn)為患者體內(nèi)胰島素絕對不足,必須依賴外源性胰島素降低血糖。1948年Albright和Reifenstein首次提出了糖尿病型骨質(zhì)疏松癥(Diabetic Osteoporosis,DOP)這一概念,明確指出糖尿病患者血糖長期控制不良容易發(fā)生骨質(zhì)疏松。糖尿病型骨質(zhì)疏松癥是指在糖尿病基礎(chǔ)上并發(fā)骨量減少,骨脆性增加,骨顯微結(jié)構(gòu)受損的全身代謝性骨病。眾所周知,骨組織的改建與成熟主要由骨形成和骨吸收兩個過程不停地循環(huán)交替來完成。研究表明,DM1主要導(dǎo)致骨形成降低。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)具有成骨分化和成脂分化的能力。成骨分化受到眾多信號通路及相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的影響,其中Nfic為核因子I(Nuclear factor-1, Nfi)家族的四個成員之一,過表達(dá)的Nfic可促使成骨細(xì)胞分化增加,新骨形成。此外,Nfic也可通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體Y (peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)的表達(dá),抑制BMSCs的成脂分化,顯示出與年齡及激素水平相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥樣的表型。本實驗主要研究：1、1型糖尿病大鼠模型建立及首次建模失敗后的補(bǔ)救措施及其效果；2、糖尿病大鼠模型胰腺組織學(xué)改變及模型的穩(wěn)定性；3、1型糖尿病大鼠Nfic與其它成骨相關(guān)基因(Runx2、OSX、IGF-1、BMP-2)及成骨特異性標(biāo)記基因(COL2A1、OC、ALP)的表達(dá)狀況；4、1型糖尿病大鼠成脂基因PPARy的表達(dá)情況；5、Nfic基因表達(dá)變化對成骨相關(guān)基因及成脂基因PPARγ表達(dá)的影響；6、胰島素對1型糖尿病大鼠Nfic及成骨成脂基因表達(dá)的干預(yù)作用。第一部分：1型糖尿病大鼠模型的制備、建模失敗后補(bǔ)救措施及胰島素對大鼠模型的治療效果目的研究通過鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)建立1型糖尿病大鼠模型的方法及首次建模失敗后的補(bǔ)救措施及效果,并對胰島素對大鼠模型的干預(yù)作用進(jìn)行初步探究。方法：健康6-8周齡雄性Wistar大鼠30只,隨機(jī)分為2組,建模組25只,對照組5只。給予建模組大鼠一次性大劑量腹腔注射STZ(65mg/kg),同時對照組大鼠腹腔注射相同體積的檸檬酸緩沖液。72h后檢測大鼠的血糖值判斷建模是否成功。首次建模成功的大鼠隨機(jī)分為兩組,模型組和治療組。治療組于實驗開始的第四天按(4-6U/kg/d)給予中效胰島素皮下注射。對首次建模失敗的大鼠常規(guī)飼養(yǎng)一周,再次腹腔注射STZ(65mg/kg),并命名為補(bǔ)救組,觀察其成模狀況。分別在建模后第0、2、4、6、8周測量大鼠的體重與血糖并觀察其一般情況。于建模后第8周處死全部大鼠,取胰腺標(biāo)本進(jìn)行HE染色和胰島素的免疫組化染色,觀察胰腺組織的病理學(xué)改變。結(jié)果：1、體重狀況：模型組與補(bǔ)救組大鼠體重降低或保持不變,對照組及治療組大鼠體重增加明顯。2、血糖狀況：建模組有21只大鼠首次注射STZ 72h后,血糖值達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn)(隨機(jī)血糖值≥16.7mmol/L),4只血糖值未達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn),再次注射STZ72h后血糖值檢測均達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn)。在建模成功組中隨機(jī)選取20只均分為模型組和治療組。持續(xù)觀察8周,模型組大鼠均成模穩(wěn)定,糖尿病癥狀明顯,未見血糖轉(zhuǎn)復(fù)正常。治療組大鼠胰島素治療后,血糖由高血糖狀態(tài)降為正常水平。對照組大鼠各項指標(biāo)均未見異常。3、胰腺組織細(xì)胞學(xué)觀察可見：對照組大鼠胰島形態(tài)規(guī)則,細(xì)胞數(shù)目正常。與對照組相比,模型組、治療組及補(bǔ)救組大鼠胰島形態(tài)不規(guī)則,體積萎縮變小,胰島內(nèi)分泌細(xì)胞數(shù)量明顯減少。補(bǔ)救組與模型組相比,其胰島形態(tài)更不規(guī)則。與模型組相比,治療組胰島體積稍大,內(nèi)分泌細(xì)胞排列更加整齊。4免疫組化觀察：胰島素胰腺免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),與對照組相比,模型組和補(bǔ)救組胰島素分布面積顯著減少。補(bǔ)救組與模型組相比,其胰島素分布面積略有增加。治療組胰島素分布面積略大于模型組。結(jié)論：一次性大劑量腹腔注射STZ可制備有效、穩(wěn)定的1型糖尿病大鼠模型。首次建模失敗后,適時再次注射STZ仍可制備高質(zhì)量的1型糖尿病大鼠模型。胰島素治療可使1型糖尿病大鼠保持正常的血糖水平,在一定程度上對胰腺細(xì)胞產(chǎn)生治療作用。第二部分：糖尿病大鼠Nfic與其它成骨相關(guān)基因表達(dá)的探究及胰島素的干預(yù)作用目的探究糖尿病大鼠Nfic及成骨相關(guān)基因的表達(dá)變化及關(guān)系,研究胰島素對糖尿病大鼠骨代謝的干預(yù)作用。方法 1型糖尿病大鼠模型制作同前,將大鼠分為3組,對照(正常)組(5只)、糖尿病模型組(10只)、胰島素治療組(10只)。治療組于建模成功后第四天按(4-6U/kg/d)給予中效胰島素皮下注射。觀察三組大鼠體重、血糖變化；8周后處死全部大鼠,胰腺組織進(jìn)行HE染色及胰島素的免疫組化檢測；Q-PCR法檢測雙側(cè)股骨Runx2、Osterix (OSX)、Nfic、 COL2A1、OC(骨鈣素)、ALP、BMP-2、IGF-1(胰島素樣生長因子-1)的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果Q-PCR檢測發(fā)現(xiàn),OC、IGF-1、Runx2、OSX基因mRNA表達(dá)中,模型組明顯低于對照組與治療組,治療組與對照組無顯著差異。COL2A1基因的mRNA表達(dá)中,模型組明顯低于對照組與治療組(p0.001,p0.01),治療組的表達(dá)量顯著低于對照組(p0.05)。ALP基因的mRNA表達(dá)中,模型組及治療組均顯著高于對照組(p0.01),模型組較治療組偏低,但無顯著性差異(p0.05)。BMP-2、Nfic基因的nRNA表達(dá)中,模型組與治療組顯著低于對照組(p0.05,p0.05)。模型組與治療組之間無顯著性差異(p0.05)。結(jié)論在1型糖尿病大鼠模型中,骨組織Runx2、Nfic、OSX、BMP-2、IGF-1、OC、 COL2A1 mRNA表達(dá)水平顯著下降,ALP mRNA表達(dá)水平顯著升高,胰島素的應(yīng)用可逆轉(zhuǎn)Runx2、OSX、IGF-1、OC、COL2A1 mRNA表達(dá)的下降,促進(jìn)骨形成。第三部分糖尿病大鼠Nfic與成脂基因PPARy的表達(dá)的變化及胰島素的干預(yù)作用目的研究糖尿病大鼠中Nfic、PPARy基因mRNA的表達(dá)變化及胰島素對Nfic、 PPARy基因mRNA表達(dá)的干預(yù)作用。方法1型糖尿病大鼠模型制作同前,將大鼠分為3組,對照(正常)組(5只)、糖尿病模型組(10只)、胰島素治療組(10只)。治療組于建模成功后第四天按(4-6U/kg/d)給予中效胰島素皮下注射。模型建成后8周處死全部大鼠,Q-PCR法檢測雙側(cè)股骨Nfic、PPARγ的nRNA表達(dá)水平。結(jié)果Q-PCR檢測發(fā)現(xiàn),在Nfic基因的mRNA表達(dá)中,與對照組相比,模型組和治療組均顯著減少(p0.1)(p0.001);治療組與模型組相比,無顯著性差異。在PPARγ基因mRNA的表達(dá)中,與對照組相比,模型組和治療組均顯著增加(p0.001)(p0.5);治療組與模型組相比,顯著減少(p0.001)。結(jié)論:1型糖尿病大鼠Nfic基因mRNA表達(dá)水平下降可提高PPARγ基因mRNA的表達(dá)水平,從而促進(jìn)脂肪的形成。胰島素的干預(yù)不能完全扭轉(zhuǎn)成骨轉(zhuǎn)錄因子Nfic的減少及成脂基因PPARγ的增加。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.1

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本文編號：1288964