本文關(guān)鍵詞：脫氫表雄酮對(duì)人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞及KGN細(xì)胞株凋亡作用的研究

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【摘要】：目的：研究不同濃度DHEA對(duì)人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響。首先通過對(duì)原代人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞的干預(yù),觀察細(xì)胞線粒體凋亡蛋白BCL-2^BAX及其mRNA的表達(dá)情況；再采用不同濃度DHEA干預(yù)KGN細(xì)胞株驗(yàn)證細(xì)胞的凋亡通路。探索雄激素對(duì)卵母細(xì)胞的影響。方法：1、培養(yǎng)正常卵巢儲(chǔ)備功能患者卵巢黃素化顆粒細(xì)胞及其鑒定：收集2014年10月-12月在成都中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖中心接受體外受精-胚胎移植(Invitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)或卵胞漿單精子顯微注射(Oocyte intracellular single sperm injcetion, ICSI)治療的25-30歲正常卵巢儲(chǔ)備功能患者廢棄的卵泡液,用40%Percoll分離液純化細(xì)胞；通過FSHR進(jìn)行顆粒細(xì)胞鑒定。2、DHEA對(duì)體外培養(yǎng)原代人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞凋亡作用的研究：顆粒細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后加入不同濃度DHEA培養(yǎng)基,分為五組：陰性對(duì)照組、DHEA0.01μM組、DHEA0.1μM組、DHEA1pM組、DHEA10μM組,干預(yù)24小時(shí),用Western blot檢測(cè)BCL-2、BAX、ERK、P-ERK蛋白的表達(dá),QPCR檢測(cè)BCL-2 mRNA、 BAX mRNA的表達(dá)。3、DHEA對(duì)KGN細(xì)胞株凋亡作用的研究：①CCK-8檢測(cè)DHEA對(duì)KGN細(xì)胞株的生長抑制作用,②流式細(xì)胞儀檢測(cè)DHEA干預(yù)后的KGN細(xì)胞株凋亡情況；③ Western blot檢測(cè)ERK、P-ERK、BCL-2、BAX、AR蛋白的表達(dá),④ QPCR檢測(cè)AR mRNA、BCL-2 mRNA、BAX mRNA的表達(dá)。結(jié)果：1、回收卵子后卵泡液中的顆粒細(xì)胞呈圓形,內(nèi)含粗大的顆粒狀物質(zhì),體外培養(yǎng)24小時(shí)后顆粒細(xì)胞已貼壁,并呈梭形改變。培養(yǎng)48小時(shí),達(dá)細(xì)胞增殖高峰,細(xì)胞內(nèi)顆粒物質(zhì)豐富,偽足緊密連接。2、對(duì)體外培養(yǎng)48小時(shí)的人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞加入DHEA干預(yù)后,BCL-2蛋白表達(dá)與陰性對(duì)照組相比有逐漸下降的趨勢(shì),BCL-2 mRNA表達(dá)也有下降的趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；BAX蛋白及mRNA表達(dá)在對(duì)照組與干預(yù)組中的表達(dá)無明顯差異。DHEA干預(yù)組ERK表達(dá)量與對(duì)照組相比無明顯差異,P-ERK表達(dá)均明顯低于對(duì)照組。3、與陰性對(duì)照組相比,不同濃度的DHEA對(duì)KGN細(xì)胞株的生長抑制作用均有明顯差異(P0.05),其中DHEA10μM組對(duì)KGN細(xì)胞株生長的抑制作用最為顯著(P0.01)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡提示：隨著DHEA濃度的增加,凋亡率增加,其中DHEAlOpM組凋亡率與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。BCL-2蛋白及mRNA的表達(dá)隨著DHEA濃度的增加呈逐漸降低趨勢(shì),其中DHEA10μM組與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而BAX、AR蛋白及mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P.05)。與陰性對(duì)照組相比,干預(yù)組P-ERK的表達(dá)均下降,其中DHEA10μM組與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：1、本研究對(duì)收集的卵泡液中顆粒細(xì)胞進(jìn)行分離純化及鑒定,得到了純度較高的顆粒細(xì)胞,證明試驗(yàn)中分離純化的方法可行；2、不同濃度DHEA干預(yù)后均引起原代黃素化顆粒細(xì)胞BCL-2/BAX的下降,提示DHEA可通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡；3、不同濃度的DHEA對(duì)KGN細(xì)胞株具有生長抑制及凋亡作用,可能與P-ERK-BCL-2凋亡通路相關(guān),且不受雄激素受體(AR)的影響。本研究初步探討DHEA對(duì)正常卵巢儲(chǔ)備功能患者顆粒細(xì)胞的作用,為后續(xù)DHEA對(duì)卵巢低反應(yīng)患者的研究奠定前期試驗(yàn)基礎(chǔ)；為臨床患者DHEA的應(yīng)用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R711.75

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1 田東梅;脫氫表雄酮對(duì)人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞及KGN細(xì)胞株凋亡作用的研究[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1286620