本文關鍵詞：脫氫表雄酮對人卵巢黃素化顆粒細胞及KGN細胞株凋亡作用的研究

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【摘要】：目的：研究不同濃度DHEA對人卵巢顆粒細胞凋亡的影響。首先通過對原代人卵巢黃素化顆粒細胞的干預,觀察細胞線粒體凋亡蛋白BCL-2^BAX及其mRNA的表達情況；再采用不同濃度DHEA干預KGN細胞株驗證細胞的凋亡通路。探索雄激素對卵母細胞的影響。方法：1、培養(yǎng)正常卵巢儲備功能患者卵巢黃素化顆粒細胞及其鑒定：收集2014年10月-12月在成都中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院生殖中心接受體外受精-胚胎移植(Invitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)或卵胞漿單精子顯微注射(Oocyte intracellular single sperm injcetion, ICSI)治療的25-30歲正常卵巢儲備功能患者廢棄的卵泡液,用40%Percoll分離液純化細胞；通過FSHR進行顆粒細胞鑒定。2、DHEA對體外培養(yǎng)原代人卵巢黃素化顆粒細胞凋亡作用的研究：顆粒細胞培養(yǎng)48小時后加入不同濃度DHEA培養(yǎng)基,分為五組：陰性對照組、DHEA0.01μM組、DHEA0.1μM組、DHEA1pM組、DHEA10μM組,干預24小時,用Western blot檢測BCL-2、BAX、ERK、P-ERK蛋白的表達,QPCR檢測BCL-2 mRNA、 BAX mRNA的表達。3、DHEA對KGN細胞株凋亡作用的研究：①CCK-8檢測DHEA對KGN細胞株的生長抑制作用,②流式細胞儀檢測DHEA干預后的KGN細胞株凋亡情況；③ Western blot檢測ERK、P-ERK、BCL-2、BAX、AR蛋白的表達,④ QPCR檢測AR mRNA、BCL-2 mRNA、BAX mRNA的表達。結果：1、回收卵子后卵泡液中的顆粒細胞呈圓形,內含粗大的顆粒狀物質,體外培養(yǎng)24小時后顆粒細胞已貼壁,并呈梭形改變。培養(yǎng)48小時,達細胞增殖高峰,細胞內顆粒物質豐富,偽足緊密連接。2、對體外培養(yǎng)48小時的人卵巢黃素化顆粒細胞加入DHEA干預后,BCL-2蛋白表達與陰性對照組相比有逐漸下降的趨勢,BCL-2 mRNA表達也有下降的趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義；BAX蛋白及mRNA表達在對照組與干預組中的表達無明顯差異。DHEA干預組ERK表達量與對照組相比無明顯差異,P-ERK表達均明顯低于對照組。3、與陰性對照組相比,不同濃度的DHEA對KGN細胞株的生長抑制作用均有明顯差異(P0.05),其中DHEA10μM組對KGN細胞株生長的抑制作用最為顯著(P0.01)。流式細胞儀檢測細胞凋亡提示：隨著DHEA濃度的增加,凋亡率增加,其中DHEAlOpM組凋亡率與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。BCL-2蛋白及mRNA的表達隨著DHEA濃度的增加呈逐漸降低趨勢,其中DHEA10μM組與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而BAX、AR蛋白及mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義(P.05)。與陰性對照組相比,干預組P-ERK的表達均下降,其中DHEA10μM組與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論：1、本研究對收集的卵泡液中顆粒細胞進行分離純化及鑒定,得到了純度較高的顆粒細胞,證明試驗中分離純化的方法可行；2、不同濃度DHEA干預后均引起原代黃素化顆粒細胞BCL-2/BAX的下降,提示DHEA可通過線粒體凋亡途徑誘導顆粒細胞凋亡；3、不同濃度的DHEA對KGN細胞株具有生長抑制及凋亡作用,可能與P-ERK-BCL-2凋亡通路相關,且不受雄激素受體(AR)的影響。本研究初步探討DHEA對正常卵巢儲備功能患者顆粒細胞的作用,為后續(xù)DHEA對卵巢低反應患者的研究奠定前期試驗基礎；為臨床患者DHEA的應用提供試驗基礎。
【學位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R711.75

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1 田東梅;脫氫表雄酮對人卵巢黃素化顆粒細胞及KGN細胞株凋亡作用的研究[D];成都中醫(yī)藥大學;2016年

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本文編號：1286620