本文關(guān)鍵詞：人GJB6基因突變對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖與凋亡的影響和機(jī)制

  更多相關(guān)文章： 有汗性外胚葉發(fā)育不良 縫隙連接蛋白 Tet-on HaCaT細(xì)胞 凋亡

【摘要】：目的有汗性外胚葉發(fā)育不良(hidrotic ectodermal dysplasia, HED)是一種常染色體顯性外胚葉發(fā)育不良疾病。當(dāng)編碼Cx30縫隙連接蛋白的GJB6基因發(fā)生突變時(shí),可引起耳聾和有汗性外胚葉發(fā)育不良。本研究中,以Tet-on慢病毒為載體建立穩(wěn)定表達(dá)GJB6基因及其突變體的HaCaT細(xì)胞株,進(jìn)一步了解GJB6基因突變引起HaCaT細(xì)胞凋亡的機(jī)制,初步探究GJB6基因突變體引起HED不同臨床表型的可能機(jī)制。方法利用PCR技術(shù)擴(kuò)增人GJB6基因野生型與突變型(A88V、G11R)基因,重組Tet-on'慢病毒質(zhì)粒,經(jīng)基因測(cè)序及酶切技術(shù)對(duì)其鑒定,再將重組慢病毒轉(zhuǎn)染入HaCaT細(xì)胞,經(jīng)puromycin篩選出穩(wěn)定表達(dá)編碼縫隙連接蛋白Cx30的GJB6基因的細(xì)胞株。細(xì)胞株加四環(huán)素(DOX)誘導(dǎo)后,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)GJB6基因的mRNA表達(dá)量,同時(shí)通過(guò)Western blot檢測(cè)Cx30的表達(dá),從而對(duì)穩(wěn)定表達(dá)GJB6基因的HaCaT細(xì)胞株進(jìn)行鑒定。用CCK8法檢測(cè)GJB6基因野生型與突變型經(jīng)DOX誘導(dǎo)表達(dá)后對(duì)細(xì)胞增殖的影響。利用流式細(xì)胞分析法檢測(cè)加DOX誘導(dǎo)基因表達(dá)后對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響。通過(guò)Western blot檢測(cè)HED相關(guān)臨床表型指標(biāo)和相關(guān)凋亡指標(biāo)的蛋白水平的變化。結(jié)果經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定重組慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功。RT-PCR檢測(cè)到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HaCaT細(xì)胞中GJB6基因的mRNA表達(dá)量明顯增加,WT(加四環(huán)素)組GJB6基因表達(dá)豐度是WT(不加四環(huán)素)組的113.369倍(P0.05)； A88V(加四環(huán)素)組GJB6基因表達(dá)豐度是A88V(不加四環(huán)素)組的3.249倍(P0.05)；G11R(加四環(huán)素)組GJB6基因表達(dá)豐度是G11R(不加四環(huán)素)組的32.011倍(P0.05)；Western blot可檢測(cè)到經(jīng)DOX處理的WT組和A88V組、G11R組穩(wěn)定表達(dá)Cx30,而未經(jīng)DOX處理的細(xì)胞和NC組細(xì)胞未檢測(cè)到Cx30目的條帶。NC組：加入四環(huán)素與不加入四環(huán)素在各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)(4、8、12、24、36、48 h)吸光度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；WT組：加入四環(huán)素與不加入四環(huán)素在以下時(shí)間節(jié)點(diǎn)(4、8、12、24、36 h)吸光度值存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；A88V組：加入四環(huán)素與不加入四環(huán)素在各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)(4、8、12、24、36、48 h)吸光度值均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；G11R組：加入四環(huán)素與不加入四環(huán)素在各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)(4、8、12、24、36、48 h)吸光度值均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。流式細(xì)胞分析法檢測(cè)到相比NC組、WT組,A88V、G11R組明顯降低了細(xì)胞的增值率,導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞的凋亡,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,P0.05。加入四環(huán)素誘導(dǎo)后,GJB6基因突變型A88V.G11R可引起內(nèi)披蛋白表達(dá)量降低,絲聚蛋白、角蛋白K6b、兜甲蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化。凋亡指標(biāo)Bcl-2、Bax的表達(dá)量無(wú)明顯改變；Caspase 3、Caspase8、Caspase9、 PARP等凋亡相關(guān)指標(biāo)可見(jiàn)其剪切體。結(jié)論成功構(gòu)建出穩(wěn)定表達(dá)GJB6基因野生型及其突變體A88V.G11R的HaCaT細(xì)胞株,進(jìn)一步探究了突變型A88V、G11R導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制,初步了解GJB6基因突變體引起HED不同臨床表型的可能機(jī)制,為下一步研究其發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R596.1

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