本文關(guān)鍵詞：胚胎期及出生早期脂多糖暴露對(duì)小鼠骨骼發(fā)育和成年期骨穩(wěn)態(tài)的影響

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【摘要】：骨骼系統(tǒng)是由骨組織和骨髓共同構(gòu)成。近年來(lái)不斷有研究發(fā)現(xiàn),骨骼除了具有運(yùn)動(dòng)、保護(hù)內(nèi)臟器官、支撐人體、參與調(diào)節(jié)鈣磷代謝等基本功能外,還是一個(gè)多功能器官,參與多種生理、病理過(guò)程并發(fā)揮重要作用。在骨髓微環(huán)境中,造血干細(xì)胞生成各種血液細(xì)胞,成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞影響造血干細(xì)胞的生成和動(dòng)員,此外,骨骼還能夠像內(nèi)分泌器官一樣產(chǎn)生多種激素、生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子,由此可見(jiàn)骨骼系統(tǒng)的重要性,骨骼通過(guò)與其他器官、系統(tǒng)協(xié)同作用,維持人體正常的生理活動(dòng)。骨骼上述重要功能的發(fā)揮依賴于骨骼穩(wěn)態(tài)的維持。成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成及破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收相互耦聯(lián)調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)平衡。當(dāng)骨形成減少或骨吸收增加均可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)生。骨質(zhì)疏松(osteoporosis)是一種以骨強(qiáng)度降低為主要表現(xiàn)的慢性代謝性骨骼疾病,隨著我國(guó)人口老齡化的趨勢(shì),骨質(zhì)疏松的發(fā)病率也逐年增加,現(xiàn)已成為嚴(yán)重影響我國(guó)老年人健康的高發(fā)病。骨質(zhì)疏松可導(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)增加,其中最嚴(yán)重的并發(fā)癥---髖部骨折,其致死、致殘率高。然而骨質(zhì)疏松的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明,吸煙、飲酒、絕經(jīng)、遺傳等因素都與其發(fā)病相關(guān)。健康和疾病的發(fā)育起源(The developmental origins of health and disease,DOHa D)假說(shuō)認(rèn)為人類在發(fā)育過(guò)程的早期(包括胎兒、嬰兒、幼兒時(shí)期)接受的多種不利因素(如藥物、酒精、營(yíng)養(yǎng)不良、缺氧、炎癥等)可影響包括骨質(zhì)疏松、糖脂代謝、哮喘、腫瘤、心血管系統(tǒng)疾病、精神神經(jīng)系統(tǒng)疾病等在內(nèi)的多種成年期慢性非傳染性疾病(non-communicable diseases,NCDs)的發(fā)生、發(fā)展。但生命早期(孕期和產(chǎn)后早期)不利因素的刺激對(duì)骨骼發(fā)育及其成年期骨穩(wěn)態(tài)的具體作用及其可能的機(jī)制尚不清楚。明確這點(diǎn)有助于揭示骨質(zhì)疏松新的發(fā)病機(jī)制,并從更廣泛的意義闡明生命早期不利因素刺激與成年期慢性非傳染性疾病的發(fā)育起源的關(guān)系。炎癥因素是臨床上個(gè)體發(fā)育過(guò)程的早期接受的常見(jiàn)不利因素之一,如孕期的牙齦感染、上呼吸道感染、宮內(nèi)感染等。此外,嬰幼兒時(shí)期的個(gè)體免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟,抵抗力差,炎性疾病的發(fā)病率較高。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏染色陰性細(xì)菌外膜的主要成分,存在于多種病原菌中,可導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。因此本研究以LPS為致炎因子處理骨組織或動(dòng)物模型,觀察胚胎期及出生早期炎癥因素刺激對(duì)骨骼發(fā)育及成年期骨穩(wěn)態(tài)的影響。目的:利用胚胎期及出生后早期LPS刺激模型,檢測(cè)生長(zhǎng)板長(zhǎng)度、體格參數(shù)、骨量、破骨細(xì)胞活性、成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞相關(guān)基因m RNA表達(dá)情況等指標(biāo)以明確生命早期炎癥因素對(duì)骨骼發(fā)育及骨穩(wěn)態(tài)的影響。方法:第一部分:1.分離E18.5 d小鼠跖骨和脛骨,分為對(duì)照組及LPS組,LPS組以10μg/m L LPS(0111:B4)處理7d。2.第1、7天測(cè)量跖骨和脛骨全長(zhǎng)及礦化帶長(zhǎng)度,計(jì)算跖骨和脛骨全長(zhǎng)增長(zhǎng)率(TL-rate)、礦化帶增長(zhǎng)率(CZ-rate)、第7天礦化帶占骨全長(zhǎng)的比例(CZ%)。3.培養(yǎng)7d后標(biāo)本取材,臧紅固綠、甲苯胺藍(lán)染色觀察肥大帶寬度;Ⅱ型膠原(collagenⅡ,ColⅡ)、Ⅹ型膠原(collagenⅩ,ColⅩ)免疫組化染色觀察軟骨細(xì)胞分化;TUNEL染色觀察軟骨細(xì)胞凋亡。4.C57小鼠分為L(zhǎng)PS組和對(duì)照組,于E15.5腹腔注射LPS(0111:B4)25ug/kg,或等劑量生理鹽水,子代小鼠2m、4m及8m取材。5.小鼠宏觀表型觀察:體重、尾長(zhǎng)。6.整體X光、離體股骨X光、離體股骨Micro-CT掃描檢測(cè)小鼠骨量變化。7.臧紅固綠染色測(cè)量生長(zhǎng)板厚度、HE染色觀察骨小梁、TRAP染色觀察破骨細(xì)胞活性。8.定量PCR檢測(cè)股骨組織成骨相關(guān)基因(OP、OC)及破骨相關(guān)基因(Tracp、Ctsk、Mmp9)的表達(dá)。第二部分:1.出生后5d的C57小鼠分為L(zhǎng)PS組和對(duì)照組,LPS組腹腔注射LPS(0111:B4)2mg/kg,對(duì)照組腹腔注射等劑量生理鹽水,2m、4m及8m取材。2.同第一部分5~8。結(jié)果:第一部分:1.與對(duì)照組比較,LPS處理后跖骨和脛骨TL-rate及CZ-rate明顯降低(跖骨TL-rate P=0.025);(跖骨CZ-rate P=0.019);(脛骨TL-rate P=0.010);(脛骨CZ-rate P=0.024)。LPS組脛骨肥大帶較對(duì)照組明顯變短(P0.001)。與對(duì)照組比較,LPS組脛骨的軟骨分化相關(guān)蛋白CoⅡ、ColⅩ表達(dá)降低,軟骨細(xì)胞凋亡明顯增加。2.胚胎期LPS暴露小鼠身出生后身長(zhǎng)變短、體重下降(P0.05)。3.胚胎期LPS暴露的小鼠成年期骨密度較對(duì)照小鼠降低。Micro-CT發(fā)現(xiàn)與同齡對(duì)照組小鼠比較,LPS組小鼠骨小梁BV/TV下降(P0.05)、Tb.N減少(P0.05)、Tb.Th減少(P0.05)、Tb.Sp增高(P0.05)、SMI增高(P0.05),骨皮質(zhì)BV/TV下降(P0.05)、C.Th減少(P0.05)。4.胚胎期LPS暴露的小鼠成年期生長(zhǎng)板窄于同齡對(duì)照組小鼠(P0.05),且其骨小梁稀疏,反映破骨細(xì)胞功能的指標(biāo)Oc.S/BS、N.Oc/t.Ar、N.Oc/B.Pm高于對(duì)照組(P0.05)。。5.胚胎期LPS暴露的小鼠成年期成骨(OP、OC)相關(guān)基因表達(dá)降低(P0.05)、破骨相關(guān)基因(Tracp、Ctsk、Mmp9)表達(dá)增高(P0.05)。第二部分:1.出生早期LPS刺激的小鼠身長(zhǎng)、體重均明顯低于對(duì)照組(P0.05)。2.出生早期LPS刺激的小鼠2m、4m、8m時(shí)間點(diǎn)骨密度降低,Micro-CT結(jié)果示LPS組骨小梁BV/TV下降(P0.05)、Tb.N減少(P0.05)、Tb.Th減少(P0.05)、Tb.Sp增高(P0.05)、SMI增高(P0.05),同時(shí),骨皮質(zhì)BV/TV下降(P0.05)、C.Th減少(P0.05)。3.出生早期LPS刺激的小鼠在成年期生長(zhǎng)板窄于對(duì)照組(P0.05)、骨小梁比對(duì)照組稀疏,破骨細(xì)胞Oc.S/BS、N.Oc/t.Ar、N.Oc/B.Pm高于對(duì)照組(P0.05)。4.出生早期LPS刺激的小鼠在成年期2m、4m、8m時(shí)間點(diǎn)的成骨相關(guān)基因(OP、OC)(P0.05)表達(dá)降低、破骨相關(guān)基因(Tracp、Ctsk、Mmp9)表達(dá)增高(P0.05)。結(jié)論:第一部分:LPS通過(guò)抑制軟骨增生、分化及促進(jìn)肥大帶軟骨細(xì)胞凋亡來(lái)抑制胚胎期小鼠骨骼發(fā)育。胚胎期LPS刺激導(dǎo)致小鼠成年期骨量降低,可能與成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)下降、破骨細(xì)胞吸收相關(guān)基因表達(dá)增加,破骨數(shù)量增加、骨吸收活性增強(qiáng)有關(guān)。第二部分:出生早期一過(guò)性LPS刺激可抑制小鼠骨骼發(fā)育,且其成年期出現(xiàn)骨量降低,可能與骨形成抑制及骨吸收增強(qiáng)有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R580

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本文編號(hào)：1254484