本文關(guān)鍵詞：雷公藤多苷對(duì)糖尿病大鼠腎組織纖維化影響及機(jī)制的研究

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【摘要】：目的糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)患者最主要的微循環(huán)并發(fā)癥發(fā)生于腎臟的表現(xiàn),主要累及腎小球,導(dǎo)致腎小球?yàn)V過率增高,蛋白濾過增加,出現(xiàn)大量蛋白尿,同時(shí)也是導(dǎo)致終末期腎病(End stage renal disease,ESRD)的最主要原因。隨著DM患病人數(shù)的與日俱增,如何防止DN發(fā)生及進(jìn)展越來越獲得普遍關(guān)注。既往很多實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷(Tripterygium Wilfordii Polyglucosides,TWP)有較強(qiáng)的抗炎和調(diào)節(jié)免疫作用,其作用特點(diǎn)是多部位,多靶點(diǎn),既能作用于T細(xì)胞、樹突狀免疫細(xì)胞等,又可抑制炎癥因子、粘附因子、趨化因子等分泌,從而達(dá)到治療多種自身免疫性疾病的效果。近幾年大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí),TWP可通過抗炎、免疫抑制作用減輕足細(xì)胞和基底膜受損程度,從而降低尿白蛋白排出,緩解腎小球硬化程度,延緩DN的發(fā)展過程,但TWP對(duì)DM大鼠腎臟纖維化及細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)沉積的作用機(jī)理尚不清楚。既往很多研究集中于TGF-β1/Smad信號(hào)通路在心臟纖維化、肺纖維化及腎纖維化過程中的作用,但對(duì)TGF-β1/NF-κB信號(hào)通路對(duì)腎纖維化的作用機(jī)理尚未明確。因此,本研究以高糖高脂飲食聯(lián)合尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ)行造模的DM大鼠為研究對(duì)象,采用ELISA方法、q-PCR方法、Western印跡方法及免疫組化方法,旨在研究TWP對(duì)TGF-β1/NF-κB信號(hào)通路的影響,從而進(jìn)一步明確TWP對(duì)DM大鼠腎組織纖維化的作用。方法清潔級(jí)雄性SD大鼠70只,按照隨機(jī)數(shù)字表,隨機(jī)選取10只作為正常對(duì)照組(NC組,n=10)喂養(yǎng)常規(guī)飼料。其余60只大鼠高糖、高脂飼料喂養(yǎng)8周后予尾靜脈注射鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ,30mg/kg)建立2型糖尿病(T2DM)模型。將造模成功后的大鼠再隨機(jī)分為模型對(duì)照組(DM)、根據(jù)應(yīng)用TWP劑量的多少進(jìn)一步分為低(tripterygium glycosides,L-TWP,1mg/kg·d)、中(tripterygium glycosides,M-TWP,3mg/kg·d)、高(tripterygium glycosides,H-TWP,6mg/kg·d)劑量,每組各15只。造模成功后即開始灌胃,NC組和DM組以等量蒸餾水(2ml)灌胃,灌胃8周末處死取材。飼養(yǎng)動(dòng)物期間按時(shí)記錄大鼠體重(BW)、血糖、24小時(shí)尿微量白蛋白(UMA)變化;處死大鼠階段記錄bw、腎重(kw);留取血標(biāo)本檢測(cè)血糖、肝腎功能、血脂及血常規(guī);采用elisa法檢測(cè)大鼠血清中tgf-β1、nf-κbp65、iv型膠原(collageniv,col-iv)、纖連蛋白(fibronection,fn)、層粘連蛋白(laminin,ln);留取腎組織標(biāo)本,光鏡下觀察大鼠腎組織腎小球病理改變;采用q-pcr法、western印跡法分別從基因水平、蛋白水平檢測(cè)大鼠腎組織中tgf-β1、nf-κbp65、col-iv、fn、ln水平,采用免疫組化法檢測(cè)上述各因子蛋白表達(dá)的腎組織定位情況。結(jié)果1.與nc組相比,高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周后,大鼠血甘油三酯(tg)、總膽固醇(tc)、空腹胰島素(fins)、胰島素抵抗指數(shù)(homa-ir)和胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(homa-β)高于nc組(p0.05);stz注射后大鼠較nc組大鼠體重降低,同時(shí)伴有多飲、多尿、多食等癥狀表明t2dm大鼠造模成功。2.一般指標(biāo):(1)體重、血糖:與nc組相比,dm組大鼠造模后血糖顯著上升(p0.05),體重顯著減輕(p0.05);(2)腎重指數(shù)(kw/bw):與nc相比,dm組大鼠kw/bw明顯升高(p0.05),twp治療組中,kw/bw均有所下降(p0.05),以h-twp組下降最為顯著(p0.05);(3)血脂:與nc組相比,dm組大鼠tg、tc水平顯著升高(p0.05),twp治療組未見顯著改變(p0.05);(4)肝、腎功能、血常規(guī):大鼠肝、腎功能和血常規(guī)在各組間均無明顯差異(p0.05)。3.24h尿微量白蛋白(24huma):(1)與nc組相比,dm組大鼠uma水平顯著升高(p0.05);與dm組相比,twp治療組大鼠uma水平顯著降低(p0.05),且呈劑量依賴性。4.各組大鼠腎小球病理形態(tài)學(xué)變化:nc組腎組織結(jié)構(gòu)正常;dm組he染色可見腎組織內(nèi)大片炎性細(xì)胞浸潤(rùn),masson染色可見腎組織出現(xiàn)明顯纖維化,pas染色可見腎小球基底膜增厚。經(jīng)不同劑量twp干預(yù)后,上述病理改變明顯減輕,且呈劑量依賴性改善。5.采用elisa法檢測(cè)大鼠血清中tgf-β1、nf-κbp65、col-iv、fn、ln水平:(1)與nc組相比,dm組血清tgf-β1、nf-κbp65、col-iv、fn、ln含量明顯增多(p0.05);與dm組相比,twp治療組血清tgf-β1、nf-κbp65、col-iv、fn、ln含量顯著下降(p0.05),且呈劑量依賴性下降。6.應(yīng)用q-pcr法檢測(cè)大鼠腎組織中tgf-β1、nf-κbp65、col-iv、fn、lnmrna的表達(dá):(1)與nc組相比,dm組腎組織中tgf-β1、nf-κbp65、COL-IV、FN、LN mRNA表達(dá)水平顯著增多(P0.05);與DM組相比,TWP治療組腎組織中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN表達(dá)水平顯著降低(P0.05),且呈劑量依賴性降低。7.應(yīng)用Western印跡法檢測(cè)大鼠腎組織中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN蛋白的表達(dá):(1)與NC組相比,DM組腎組織中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN蛋白表達(dá)顯著增多(P0.05);與DM組相比,TWP治療組腎組織中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN蛋白表達(dá)顯著下降(P0.05),且呈劑量依賴性下降。8.應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)大鼠腎組織中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN蛋白的表達(dá):與NC組相比,DM組腎小球內(nèi)可見標(biāo)記的TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN細(xì)胞浸潤(rùn)(P0.05);TWP組可見腎組織中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN表達(dá)明顯降低(P0.05),M-TWP組、H-TWP組較L-TWP組下降更加明顯(P0.05)。結(jié)論1.TGF-β1介導(dǎo)腎臟纖維化發(fā)生、發(fā)展過程,NF-κB炎性反應(yīng)信號(hào)通路所起的作用不容忽視。TWP干預(yù)組較DM組大鼠KW/BW、24h UMA及病理改變均有所改善,且呈劑量依懶性。2.雷公藤多苷具有獨(dú)特抗炎、免疫抑制作用,可抑制系膜細(xì)胞的增生,改善腎小球基底膜電荷狀態(tài)抑制蛋白排出,減輕腎小球纖維化。3.TGF-β1及其活化的NF-κB炎性反應(yīng)信號(hào)通路共同介導(dǎo)ECM的合成,而且其又協(xié)同促進(jìn)IV型膠原(COL-IV)、纖連蛋白(FN)及層粘連蛋白(LN)合成,共同介導(dǎo)糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展過程。4.TWP通過抑制TGF-β1/NF-κB信號(hào)通路,改善DM腎組織纖維化病變,且呈劑量依賴性改善。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9

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本文編號(hào)：1243058