本文關(guān)鍵詞：托里消毒散對糖尿病創(chuàng)面血管生成的影響及機制研究

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【摘要】：目的本研究選用鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)尾靜脈注射和背部打孔法建立的糖尿病皮膚潰瘍大鼠模型和人腦微血管周細胞為研究對象,采用全方干預(yù)及拆方(托法、透法)分治的方法對托里消毒散對糖尿病創(chuàng)面血管生成的影響及機制進行探討。方法1.200只健康雄性SD大鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后隨機分為兩組,正常組40只,糖尿病組160只。糖尿病組大鼠禁食12h后予45mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)(0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液稀釋)尾靜脈注射制備糖尿病模型,正常組大鼠尾靜脈注射等體積的0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液,以2次或2次以上隨機血糖≥16.7mmol/L為糖尿病模型誘導(dǎo)成功,死亡及未成模的大鼠予以剔除。所有大鼠常規(guī)飼料喂養(yǎng)4周后苯巴比妥麻醉,利用直徑1cm打孔器在背部打孔,制備皮膚潰瘍動物模型,死亡及未成模的大鼠予以剔除。皮膚潰瘍成模的糖尿病組大鼠隨機分為四組:糖尿病組,糖尿病+托法組,糖尿病+透法組,糖尿病+全方組,皮膚潰瘍成模的正常組大鼠即為對照組。糖尿病+全方組大鼠給予托里消毒散全方(當歸1.5g/kg,黃芪1.5g/kg,白芷1.2g/kg,皂角刺1.2g/kg)灌胃,糖尿病+托法組大鼠給予托法方藥(當歸1.5g/kg,黃芪1.5g/kg)灌胃,糖尿病+透法組大鼠給予透法方藥(白芷1.2g/kg,皂角刺1.2g/kg)灌胃,對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃,各組大鼠灌胃量控制在2ml左右,每天給藥一次,連續(xù)給藥14d。分別在創(chuàng)傷后5d、8d、11d、14d觀察評價潰瘍愈合狀態(tài),計算創(chuàng)面愈合率,并處死取潰瘍組織備用。采用HE染色觀察創(chuàng)面肉芽組織結(jié)構(gòu)改變,應(yīng)用RT-PCR法、Western Blotting法和免疫組織化學法檢測當尿病大鼠潰瘍組織中Ang-1、Ang-2和Tie-2的m RNA和蛋白的表達。2.體外培養(yǎng)人腦微血管周細胞(Human brain vascular pericyte,HBVP)和人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),用不同濃度的當歸,黃芪,白芷,皂角刺提取物干預(yù)周細胞和內(nèi)皮細胞,觀察不同藥物提取物對周細胞增殖,遷移,凋亡以及內(nèi)皮細胞對周細胞的趨化作用的影響。結(jié)果1.體內(nèi)實驗1.1造模情況:糖尿病組160只大鼠中有8只大鼠未達到糖尿病成模標準,4只大鼠注射STZ后死亡,剔除實驗,糖尿病成模率為148/160=92.5%;皮膚潰瘍模型手術(shù)后至實驗終點,各組大鼠死亡情況為,對照組死亡1只,糖尿病組死亡5只,糖尿病+托法組死亡3只,糖尿病+透法組死亡4只,糖尿病+全方組死亡3只。1.2各時間點各干預(yù)組愈合率均高于糖尿病組(P(27)0.05);創(chuàng)傷后5d,糖尿病+透法組愈合率高于糖尿病+托法組和糖尿病+全方組(P(27)0.05);創(chuàng)傷后8、11、14d,糖尿病+全方組愈合率高于糖尿病+托法組和糖尿病+透法組(P(27)0.05)。1.3糖尿病+全方組各時間點肉芽組織中Ang-1、Tie-2表達水平均高于糖尿病組,Ang-2表達水平均低于糖尿病組(P(27)0.05);創(chuàng)傷后5、8d,糖尿病+透法組Ang-2表達水平明顯下調(diào)(P(27)0.05);創(chuàng)傷后11、14d,糖尿病+托法組Ang-1、Tie-2表達水平上調(diào)(P(27)0.05)。2體外實驗2.1中藥提取物對高糖條件下周細胞增殖的影響:高糖條件下,周細胞的增殖明顯受抑制,不同濃度的當歸、黃芪、白芷均能改善這一抑制作用(P(27)0.05),且在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性;皂角刺作用不明顯。2.2中藥提取物對高糖條件下周細胞遷移的影響:高糖條件下,周細胞的遷移明顯受抑制,白芷能顯著改善這一抑制作用(P(27)0.05),當歸、黃芪、皂角刺作用均不明顯。2.3中藥提取物對高糖條件下周細胞凋亡的影響:Western blot顯示,高糖條件下,周細胞Caspase3激活明顯增加(P(27)0.05),黃芪可以明顯抑制高糖條件下周細胞Caspase3的激活(P(27)0.05),抑制周細胞凋亡,當歸、白芷、皂角刺效果不明顯。RT-PCR顯示,高糖條件下,抗凋亡蛋白bcl-2表達下降(P0.05),前調(diào)亡蛋白bax表達明顯增加(P0.05),黃芪提取物可以顯著降低高糖條件下周細胞bax m RNA的表達(P0.05),升高bcl-2 m RNA的表達(P0.05),抑制周細胞凋亡;當歸、白芷、皂角刺干預(yù)組bax及bcl-2表達與高糖組無統(tǒng)計學差異。2.4體外共培養(yǎng)內(nèi)皮細胞與周細胞顯示,高糖條件下,內(nèi)皮細胞對周細胞的趨化作用下降,當歸、黃芪和白芷均能促進高糖條件下內(nèi)皮細胞對周細胞的趨化作用(P0.05),皂角刺作用不明顯。結(jié)論1.通過尾靜脈注射STZ聯(lián)合背部打孔法,成功制備糖尿病皮膚潰瘍大鼠模型,且糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合明顯延遲。2.托里消毒散全方及拆方均能促進糖尿病皮膚潰瘍大鼠的創(chuàng)面愈合,全方組效果最好。3.糖尿病組大鼠創(chuàng)面中Ang-1、Tie-2表達水平下降,Ang-2表達水平升高,導(dǎo)致創(chuàng)面新生血管成熟障礙,創(chuàng)面愈合受損;透法可以在創(chuàng)傷愈合的早期下調(diào)Ang-2的表達,托法可以在創(chuàng)傷愈合的晚期上調(diào)Ang-1、Tie-2的表達,從而促進新生血管成熟,促進糖尿病創(chuàng)面的愈合。4.成功在體外培養(yǎng)原代人腦微血管周細胞及人臍靜脈內(nèi)皮細胞;高糖條件下,周細胞的增殖,遷移受抑制,凋亡增加,內(nèi)皮細胞對周細胞的趨化作用降低。5.托里消毒散四種中藥提取物均可促進周細胞的增殖;此外,白芷可以明顯促進周細胞的遷移;黃芪可以明顯抑制周細胞的凋亡;當歸,黃芪,白芷均可促進內(nèi)皮細胞對周細胞的趨化作用。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2
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本文編號：1231483