本文關(guān)鍵詞：毒死蜱吸入暴露染毒致腦損傷效應(yīng)及作用機(jī)制研究

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【摘要】：研究目的:建立全身動(dòng)態(tài)暴露毒死蜱(Chlorpyrifos,CPF)吸入染毒致大鼠認(rèn)知障礙模型,規(guī)范CPF氣溶膠粒徑及濃度,真實(shí)模擬CPF急性吸入染毒狀態(tài),確定半數(shù)致死濃時(shí)積(Median lethal concentration×time,LCt50);觀察病理、行為學(xué)、AChE、ACh、氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)及炎性反應(yīng)相關(guān)因子等在CPF染毒后不同時(shí)間、不同腦區(qū)的變化;評(píng)價(jià)不同類型抗炎藥物對(duì)CPF中毒所致認(rèn)知障礙及腦損傷的預(yù)防作用,探討CPF中毒引發(fā)乙酰膽堿酯酶、神經(jīng)遞質(zhì)及炎性反應(yīng)變化與中毒引發(fā)腦損傷的相關(guān)性。研究方法:1、CPF吸入染毒模型建立及LCt50確定。通過優(yōu)化氣溶膠發(fā)生參數(shù),建立動(dòng)物急性吸入CPF的動(dòng)態(tài)暴露環(huán)境;利用吸附采樣-氣相檢測(cè)技術(shù)監(jiān)測(cè)暴露艙內(nèi)CPF濃度,利用粒徑監(jiān)測(cè)儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)暴露艙內(nèi)CPF粒徑,同時(shí)考察濃度、粒徑隨時(shí)間的變化;將50只SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組,每組10只,置于染毒環(huán)境中進(jìn)行染毒,染毒時(shí)間分別為5、7、10、14、20 h,觀察染毒過程中動(dòng)物癥狀,記錄染毒后各劑量組10天內(nèi)的動(dòng)物死亡情況,采用Bliss法計(jì)算確定LCt50。2、CPF染毒后行為學(xué)及不同腦區(qū)病理學(xué)變化。取100只大鼠進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練,檢測(cè)空間學(xué)習(xí)記憶能力。訓(xùn)練結(jié)束后,取50只作為實(shí)驗(yàn)組,將其隨機(jī)分為5組,每組10只,以0.4 LCt50 CPF的劑量進(jìn)行全身暴露染毒;剩余50只作為對(duì)照組,正常暴露于相同條件下的空氣中,分別在染毒后1d、2d、3d、7d及14d各取10只大鼠,進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察不同腦區(qū)病理學(xué)變化。3、CPF染毒后不同時(shí)間AChE、ACh及氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)變化。將280只SD雄性大鼠隨機(jī)分為4組,每組70只,分別暴露于0、0.2、0.4、0.8倍LCt50劑量下進(jìn)行全身暴露動(dòng)態(tài)吸入CPF,分別在染毒后10min、3h、8h、1d、2d、3d和7d取5只大鼠,尾靜脈采血,采用酶聯(lián)免疫分析法,測(cè)定海馬、紋狀體及額葉皮層區(qū)AChE的表達(dá)變化;采用高效液相色譜法,測(cè)定ACh、Glu、Asp、Gly及GABA的含量變化。4.CPF染毒后不同時(shí)間炎性因子表達(dá)變化。將30只SD雄性大鼠隨機(jī)分為6組,每組5只,以0.4 LCt50 CPF的劑量進(jìn)行全身暴露動(dòng)態(tài)染毒。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法,分別在染毒后30min、3h、8h、24h、3d及7d等不同時(shí)間點(diǎn),測(cè)定額葉皮層及海馬組織IL-1β、TNF-α及NF-κB的表達(dá)變化。5.不同類型抗炎藥物對(duì)CPF染毒所致認(rèn)知障礙及腦損傷的保護(hù)作用。將25只大鼠隨機(jī)分為5組,每組5只,在染毒前30min分別尾靜脈注射tnf-α特異性拮抗劑(益賽普,3mg/kg)、nf-κb特異性拮抗劑(pdtc,2mg/kg)、廣譜抗炎藥(布洛芬,10mg/kg)及生理鹽水。以0.4lct50毒死蜱的劑量進(jìn)行全身暴露動(dòng)態(tài)染毒后3d,取出完整右腦進(jìn)行he染色,剩余完整左腦分離出額葉皮層及海馬組織測(cè)定炎性反應(yīng)相關(guān)因子il-1β、tnf-α及nf-κb的表達(dá)變化,評(píng)價(jià)不同抗炎藥物對(duì)cpf所致認(rèn)知障礙及腦損傷的預(yù)防作用。研究結(jié)果:1、本實(shí)驗(yàn)中氣溶膠粒子平均值(1.3μm)、眾數(shù)值(1.3μm)、幾何平均值(1.1μm)相近,且分布符合正態(tài)分布規(guī)律,符合oecd403/433急性吸入毒性實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)原則要求。暴露艙內(nèi)氣溶膠濃度隨時(shí)間的變化保持穩(wěn)定(160.6±11.1mg/m3),變異系數(shù)(rsd)在7%之內(nèi),提示暴露艙內(nèi)氣溶膠濃度穩(wěn)定;在此濃度條件下,大鼠吸入暴露cpflct50為1654.3mg/m3·h,lct95為3015.6mg/m3·h;2、cpf吸入染毒后動(dòng)物在1w內(nèi)出現(xiàn)了短期的空間記憶障礙,病理學(xué)觀察可見海馬及額葉皮層區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)元核固縮、形成結(jié)節(jié)或壞死,但紋狀體區(qū)未見明顯病理學(xué)改變;3、cpf吸入染毒后動(dòng)物海馬區(qū)及額葉皮層區(qū)ache活性在染毒后30min出現(xiàn)了明顯下降(p0.05),并在24h達(dá)到最低,隨后表現(xiàn)為緩慢回升,在染毒后3d較正常值仍有顯著性差異(p0.05),至染毒后7d恢復(fù)正常水平;而紋狀體區(qū)ache變化滯后,在染毒后24h才出現(xiàn)明顯下降(p0.05),3d時(shí)較正常值已無顯著性差異;4、全身暴露染毒后不同腦區(qū)ach與染毒濃度密切相關(guān),各腦區(qū)在染毒后24h時(shí)普遍達(dá)到峰值,之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。其中,海馬及額葉皮層區(qū)染毒后ach在染毒后3d較正常組仍有顯著性差異(p0.05),7d時(shí)趨于正常水平;而低劑量組紋狀體區(qū)ach在染毒后2d即趨于正常水平,中劑量及高劑量組在染毒后3d趨于正常水平;5、全身暴露染毒后不同腦區(qū)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)與染毒濃度密切相關(guān)。高濃度染毒組動(dòng)物海馬區(qū)eaas在染毒后30min時(shí)就出現(xiàn)了明顯升高(p0.05);中濃度染毒組在染毒后glu在30min首先出現(xiàn)了明顯升高(p0.05),并在48h達(dá)到表達(dá)最高值(p0.01),而asp在3h出現(xiàn)了明顯升高(p0.05),在24h達(dá)到最高;低濃度組asp在染毒后8h達(dá)到表達(dá)最高值(p0.05),而glu將持續(xù)升高至24h達(dá)到表達(dá)最高值(p0.05)。高濃度及中濃度染毒組動(dòng)物海馬eaas在染毒后7d較正常水平仍有顯著性差異(p0.05),而低濃度組在染毒后1-2d即趨于正常水平。額葉皮層區(qū)eaas有類似變化規(guī)律,并高出海馬區(qū)eaas含量一半左右,低濃度組動(dòng)物eaas升高持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng),直到染毒后3d趨于正常水平。紋狀體區(qū)變化最小,變化規(guī)律類似于海馬區(qū)。iaas變化規(guī)律類似于eaas。不同的是,高、中濃度染毒動(dòng)物iaas含量在染毒后7d已趨于正常水平;6、全身暴露染毒后動(dòng)物海馬區(qū)il-1βmrna表達(dá)含量在染毒后30min首先出現(xiàn)了明顯的表達(dá)增加(p0.05),tnf-αmrna在染毒后3h也出現(xiàn)明顯的表達(dá)增加(p0.05),而NF-κB mRNA增長(zhǎng)緩慢,直到8h才表現(xiàn)出顯著增長(zhǎng)(P0.05);IL-1β、TNF-α及NF-κB mRNA表達(dá)均在染毒后48h達(dá)到峰值(P0.01),至染毒后7d表達(dá)仍明顯高于染毒前水平(P0.05);額葉皮層區(qū)三種炎性因子表達(dá)總體與海馬存在類似的變化趨勢(shì)。不同的是,與正常對(duì)照組比較,額葉皮層區(qū)IL-1β、TNF-α及NF-κB mRNA在染毒后30min已出現(xiàn)了明顯的表達(dá)增加(P0.05);7、PDTC預(yù)防給藥組動(dòng)物海馬CA1區(qū)損傷程度有所減輕,表現(xiàn)為部分神經(jīng)元細(xì)胞核腫脹深染,個(gè)別伴有纖維纏結(jié),海馬區(qū)可見少量小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn);布洛芬預(yù)防給藥組動(dòng)物海馬CA1區(qū)損傷程度亦有所減輕,表現(xiàn)為有少量神經(jīng)元細(xì)胞核固縮深染,伴有少量纖維纏結(jié);相對(duì)于PDTC及布洛芬預(yù)防給藥組,益賽普預(yù)防給藥組海馬CA1區(qū)損傷程度更輕,細(xì)胞核質(zhì)清晰,僅見個(gè)別神經(jīng)元細(xì)胞核深染,細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常;而PDTC及益賽普預(yù)防給藥組動(dòng)物額葉皮層區(qū)損傷程度有所減輕,表現(xiàn)為部分神經(jīng)元纖維纏結(jié),細(xì)胞深染;布洛芬預(yù)防給藥組動(dòng)物額葉皮層區(qū)損傷程度有所減輕,但局灶性細(xì)胞固縮深染,細(xì)胞排列紊亂,仍有形成結(jié)節(jié)的趨勢(shì)。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)建立了CPF氣溶膠吸入染毒模型,研究結(jié)果表明動(dòng)物在CPF全身暴露染毒后,1w內(nèi)出現(xiàn)短期的空間記憶障礙。在染毒后最初幾個(gè)小時(shí),在受影響的腦區(qū)如海馬及額葉皮層組織內(nèi)突觸ACh的快速蓄積引起嚴(yán)重的興奮性毒性和膽堿能神經(jīng)元的功能障礙,破壞了細(xì)胞內(nèi)膽堿能通路的完整性,這種興奮性毒性同樣打破了谷氨酸能和GABA能活性的平衡,引起神經(jīng)元興奮性毒性損傷及炎癥反應(yīng)。這種膽堿能神經(jīng)元興奮性毒性的后果,包括廣泛的細(xì)胞內(nèi)水腫、核固縮、EAAs增加的興奮性毒性、炎性因子表達(dá)上調(diào)的神經(jīng)炎癥和應(yīng)激反應(yīng),并導(dǎo)致隨后的各種負(fù)效應(yīng),引起大腦神經(jīng)元損傷和死亡。其中基于炎性反應(yīng)的干預(yù)措施可能成為CPF所致腦損傷的新的救治手段。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R595.4

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7 整理 鄭穎t，

本文編號(hào)：1203090