本文關(guān)鍵詞：在電脈沖刺激調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞Akt機(jī)制中Axin1的作用研究

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【摘要】：目的:骨骼肌是攝取餐后葡萄糖的主要器官,胰島素刺激骨骼肌細(xì)胞攝取葡萄糖是維持血糖平衡的關(guān)鍵,攝取葡萄糖通過GLUT4轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜完成。骨骼肌胰島素抵抗是指胰島素刺激骨骼肌攝取葡萄糖的能力減弱,導(dǎo)致持續(xù)的餐后高血糖。肌肉收縮能促進(jìn)骨骼肌攝取葡萄糖,改善胰島素敏感性。本課題組致力研究肌肉收縮促進(jìn)骨骼肌葡萄糖攝取的分子機(jī)制,我們用過表達(dá)GLUT4HA的小鼠C2C12-GLUT4HA細(xì)胞株,采取電脈沖刺激的方法模擬運(yùn)動(dòng)造成的骨骼肌收縮,發(fā)現(xiàn)電刺激可以通過激活A(yù)MPK增加Rac1的活性,從而磷酸化Akt。Axin1是多功能的支架蛋白,含有與多種分子結(jié)合的位點(diǎn)或者結(jié)構(gòu)域,參與了多種生理病理過程,Axin1可能參與到運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)的AMPK信號(hào)通路。本研究用siRNA干擾技術(shù)在體外培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞中沉默Axin1蛋白,探究Axin1在電刺激作用下調(diào)節(jié)Akt的分子機(jī)制。內(nèi)容:第一部分:以3T3-L1脂肪細(xì)胞作為陽性對(duì)照,檢測(cè)大鼠L6成肌細(xì)胞、小鼠C2C12-GLUT4HA肌管細(xì)胞和小鼠骨骼肌中Axin1蛋白的表達(dá),檢測(cè)電刺激對(duì)C2C12-GLUT4HA肌管細(xì)胞中Axin1蛋白表達(dá)的影響。第二部分:采用siRNA下調(diào)C2C12-GLUTHA細(xì)胞Axin1蛋白表達(dá),檢測(cè)基因沉默效果,研究siAxin1對(duì)電刺激條件下AMPK、PAK、Akt、AS160、PKC的磷酸化水平和Rac1活性的影響,細(xì)胞水平上研究AMPK和Axin1的相互關(guān)系。第三部分:喂養(yǎng)C57BL/6小鼠到12周齡,將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、胰島素刺激組和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組,檢測(cè)各組骨骼肌中Axin1的表達(dá),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中研究AMPK和Axin1的相互關(guān)系。方法:將小鼠C2C12-GLUTHA骨骼肌細(xì)胞分化成肌管細(xì)胞,用胰島素或電脈沖刺激的方法刺激肌管細(xì)胞,免疫印跡法檢測(cè)Axin1蛋白的表達(dá)。采用siRNA技術(shù)基因沉默Axin1,Western blot檢測(cè)其對(duì)電刺激介導(dǎo)的C2C12-GLUT4HA細(xì)胞相關(guān)信號(hào)分子磷酸化水平變化的影響。12周齡的C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組(1)無任何處理的空白對(duì)照組(2)腹腔注射胰島素組(3)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組,免疫印記法測(cè)定各組Axin1的表達(dá)量,免疫共沉淀的方法測(cè)定運(yùn)動(dòng)下Axin1和AMPK相互作用。結(jié)果:第一部分結(jié)果顯示:Axin-1在L6成肌細(xì)胞、C2C12-GLUT4HA肌管細(xì)胞和小鼠骨骼肌中均表達(dá),并且電刺激C2C12-GLUT4HA肌管細(xì)胞顯著升高Axin1的蛋白水平。第二部分結(jié)果顯示:當(dāng)用siRNA技術(shù)將C2C12-GLUTHA肌管細(xì)胞中Axin1基因沉默后,顯著抑制電刺激C2C12-GLUT4HA肌管細(xì)胞后升高的AMPK、PAK、Akt和AS160信號(hào)分子的磷酸化水平、降低Rac1的活性,但對(duì)PKC的磷酸化水平無影響,Axin1和AMPK的免疫共沉淀作用在電刺激的作用下明顯加強(qiáng)。第三部分結(jié)果顯示:運(yùn)動(dòng)增加C57BL/6小鼠骨骼肌中Axin1的蛋白表達(dá),并且增強(qiáng)Axin1和AMPK的免疫共沉淀作用。結(jié)論:Axin1可能通過與AMPK形成復(fù)合物從而誘導(dǎo)電刺激激活C2C12-GLUT4HA肌管細(xì)胞中的Akt,Axin1蛋白可作為改善和治療胰島素抵抗新靶點(diǎn),有待進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.2

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本文編號(hào)：1202946