本文關(guān)鍵詞：SELDI-TOF-MS技術(shù)篩選類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血清特異性蛋白質(zhì)的研究

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【摘要】：目的:聯(lián)合表面增強(qiáng)激光解析離子化/飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)患者血清差異蛋白質(zhì),獲取相關(guān)差異蛋白質(zhì)譜圖,構(gòu)建RA診斷模型、早期診斷模型、并發(fā)有干燥綜合征(Sjogren syndrome,SS)、肺間質(zhì)病變(interstitial lung disease,ILD)、股骨頭壞死(osteonecrosis ofthe femeral head,ONPH)的診斷模型、病情活動度監(jiān)測的模型,有助于臨床上,單一芯片就可以完善RA早期診斷、疾病活動度及病情變化監(jiān)測,可以簡化臨床步驟和節(jié)約醫(yī)療費用,并為進(jìn)一步探索RA發(fā)病機(jī)制中提供技術(shù)平臺。方法:1.研究人群:依據(jù)1987年ACR或2009年ACR/EULAR診斷標(biāo)準(zhǔn),共納入的96例RA患者及76例健康對照組;2.RA患者分組如下2.1依據(jù)RA診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分組:2.1.1將納入對象隨機(jī)分為盲篩組(RA為83例和健康人群為56例)和驗證組(RA為14例和健康人群為20例);2.1.2依據(jù)1987年ACR或2009年ACR/EULAR診斷標(biāo)準(zhǔn)分組,包括符合1987年診斷標(biāo)準(zhǔn)(43例)、僅符合2009年診斷標(biāo)準(zhǔn)的RA(40例);2.1.3包括單純RA(44例)、RA-SS(18例)、RA-ILD(22例)及RA-ONPH(6例);2.2依據(jù)DAS28疾病活動度評估方法進(jìn)行分組:依據(jù)DAS282.6:病情緩解;2.6DAS≤3.2:低疾病活動度;3.2DAS≤5.1:中等疾病活動度;das5.1:高疾病活動度。包括緩解期(15例)與活動期(68例),其中低疾病活動度17例,中疾病活動度21例,高疾病活動度30例;2.3篩選差異蛋白依據(jù)血清學(xué)指標(biāo)分組,包括血清學(xué)抗體陽性組(至少一項血清學(xué)抗體(抗核抗體(ana)、抗環(huán)胍氨酸肽(ccp)抗體、抗角蛋白抗體(aka)、類風(fēng)濕因子(rf)陽性)(66例)與血清學(xué)抗體陰性組(17例)、抗ccp抗體陽性組(51例)與抗ccp抗體陰性組(32例)、rf陽性組(60例)與rf陰性組(23例);按治療分組,益賽普組(36例)、mtx組(19例)及聯(lián)合lef與hcq組(34例)。3.采集納入研究對象及11例使用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體抗體融合蛋白(益賽普)治療后血清,血清分裝并長期儲存在-80℃,僅限凍溶1次。4.seldi-tof-ms技術(shù)于2002年獲諾貝爾化學(xué)獎,為主要應(yīng)用技術(shù)maldi的一種,是蛋白質(zhì)組學(xué)主要研究手段之一。本研究主要應(yīng)用決策樹方法構(gòu)建診斷模型。5.采用seldi質(zhì)譜儀自帶的biomarkerwizard軟件初步篩選上述分組的差異蛋白質(zhì)(卡方檢驗,p0.05),并利用biomarkerpattern軟件(采用決策樹方法對目標(biāo)對象進(jìn)行分類)初步建立診斷預(yù)測模型,并計算其敏感性和特異性,用roc曲線描述診斷模型的可靠性(auc在0.5~0.7時有較低準(zhǔn)確性,auc在0.7~0.9時有一定準(zhǔn)確性,auc在0.9以上時有較高準(zhǔn)確性。auc=0.5時,說明診斷方法完全不起作用,無診斷價值。auc0.5不符合真實情況,在實際中極少出現(xiàn))。結(jié)果:1ra患者診斷模型建立1.1ra與健康組診斷模型建立將納入對象隨機(jī)分為盲篩組(ra為83例和健康人群為56例)和驗證組(ra為14例和健康人群為20例),盲篩組中發(fā)現(xiàn)58個差異蛋白峰(p0.05),通過決策樹方法發(fā)現(xiàn)由m/z3448.857、4716.712、8214.285、10645.1組成診斷模型,其敏感性可達(dá)91.566%,特異性可達(dá)92.857%,roc曲線下面積為0.937,驗證組中其敏感性可達(dá)100%,特異性可達(dá)95%。1.21987年診斷標(biāo)準(zhǔn)與2009年診斷標(biāo)準(zhǔn)的ra分組診斷模型建立43例符合1987年診斷標(biāo)準(zhǔn)與40例符合2009年診斷標(biāo)準(zhǔn)的ra患者篩選得到11個差異蛋白質(zhì)(p0.05),通過決策樹方法發(fā)現(xiàn)由m/z1679.331、m/z2032.31、m/z4465.218、m/z33897.72組成的診斷模型,其敏感性可達(dá)92.5%,特異性為81.395%,roc曲線下面積為0.909。1.3并發(fā)有ss、ild、onph的診斷模型建立1.3.144例單純ra患者與22例ra-ild患者篩選得到13個差異蛋白質(zhì)(p0.05),通過決策樹方法發(fā)現(xiàn)由m/z10645.1、m/z12595.86組成的診斷模型,其敏感性可達(dá)86.364%,特異性為84.091%,roc曲線下面積為0.856。1.3.244例單純ra患者與18例ra-ss患者篩選得到13個差異蛋白質(zhì)(p0.05),通過決策樹方法發(fā)現(xiàn)由m/z6635.623、m/z33897.72組成的診斷模型,其敏感性可達(dá)77.778%,特異性為79.545%,roc曲線下面積為0.794。1.3.344例單純ra患者與6例ra-onph篩選得到2個差異蛋白質(zhì)(p0.05),通過決策樹方法發(fā)現(xiàn)由m/z2071.689組成的診斷模型,其敏感性可達(dá)66.667%,特異性為95.445%,其roc曲線面積為0.811。2.ra患者病情活動度監(jiān)測診斷模型建立2.1ra緩解期與活動期診斷模型建立2.1.115例緩解期ra患者與17例低疾病活動度期患者檢測差異蛋白,發(fā)現(xiàn)6個蛋白峰差異具有顯著意義(p0.05),通過決策樹方法發(fā)現(xiàn)由m/z1130.776、m/z1501.065、m/z2091.198、m/z11381.87組成的診斷模型,其敏感性可達(dá)94.118%,特異性為93.333%,roc曲線下面積為0.990。2.1.215例緩解期與21例中疾病度活動期ra患者篩選差異蛋白,發(fā)現(xiàn)3個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)(p0.05),通過決策樹方法發(fā)現(xiàn)由m/z1330.019、m/z1501.065、m/z4060.468組成的診斷模型,其敏感性可達(dá)95.238%,特異性為86.667%,roc曲線下面積為0.973。2.1.315例緩解期與31例高疾病度活動期ra患者篩選差異蛋白,發(fā)現(xiàn)2個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)(p0.05),通過決策樹方法發(fā)現(xiàn)由m/z2013.494、m/z8765.232組成的診斷模型,其敏感性可達(dá)80.645%,特異性為86.667%,roc曲線下面積為0.898。2.2低級病活動期與中疾病活動期診斷模型建立17例低疾病活動期與21例中疾病度活動期ra患者篩選差異蛋白,發(fā)現(xiàn)7個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)(p0.05),通過決策樹方法發(fā)現(xiàn)由m/z2032.31、m/z2506.214、m/z9286.495組成的診斷模型,其敏感性可達(dá)90.48%,特異性為100%,roc曲線下面積為0.989。2.3中疾病活動期與高疾病活動期診斷模型建立21例中疾病活動期與31例高疾病度活動期ra患者篩選差異蛋白,篩選3個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)(p0.05),通過決策樹方法發(fā)現(xiàn)由m/z2032.31、m/z4716.71組成的診斷模型,其敏感性可達(dá)74.194%,特異性為76.190%,roc曲線下面積為0.786。2.4低級病活動期與高疾病活動期診斷模型建立17例低疾病活動期與31例高疾病度活動期ra患者篩選得到5個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)(p0.05),通過決策樹方法發(fā)現(xiàn)由m/z2013.494、m/z4825.63組成的診斷模型,其敏感性可達(dá)87.09%,特異性為88.235%,其roc曲線面積為0.916。3血清差異蛋白篩選3.1血清學(xué)抗體陽性組(至少一項血清學(xué)抗體(ana、aka、ccp、rf)陽性)與陰性組(血清學(xué)抗體陰性)66例抗體陽性組與17例抗體陰性組的ra患者篩選得到7個差異蛋白質(zhì)(p0.05),通過決策樹方法發(fā)現(xiàn)由由m/z1221.005、m/z2385.32、m/z4825.63、m/z8765.232組成的診斷模型,其敏感性可達(dá)86.567%,特異性為87.5%,roc曲線下面積為0.926。3.2抗ccp抗體陽性組與陰性組51例抗ccp抗體陽性組與32例抗ccp抗體陰性組的ra患者篩選得到5個差異蛋白質(zhì)(p0.05),通過決策樹方法發(fā)現(xiàn)由m/z1247.027、m/z2671.604、m/z4465.218、m/z28057.6組成的診斷模型,其敏感性可達(dá)94.118%,特異性為90.625%。roc曲線下面積為0.948。3.3rf陽性組與陰性組60例rf陽性組與23例rf陰性組的ra患者篩選得到6個差異蛋白質(zhì)(p0.05),通過決策樹方法發(fā)現(xiàn)由m/z1501.065組成的診斷模型,其敏感性可達(dá)78.333%,特異性為65.21%,roc曲線下面積為0.718。3.4益賽普組與mtx組36例益賽普組與19例mtx組有20個差異表達(dá)蛋白質(zhì)(p0.05),如下圖所示,其中18個蛋白峰譜在益賽普治療組中表達(dá)上調(diào),2個蛋白峰譜表達(dá)下調(diào)。3.5益賽普組與聯(lián)合lef與hcq組36例益賽普組與34例聯(lián)合lef與hcq組有2個差異表達(dá)蛋白質(zhì),其中m4060、46和m6436、40在益賽普組中表達(dá)均上調(diào)。3.6mtx組與聯(lián)合lef與hcq組19例mtx組與34例聯(lián)合lef與hcq組有14個差異表達(dá)蛋白,在mtx組中表達(dá)均下調(diào)。4益賽普治療前后血清差異蛋白比較11例接受益賽普治療的ra患者依據(jù)acr20分為有效組(7例)和無效組(4例)。有效率可達(dá)63.6%。acr20有效組和acr20無效組進(jìn)行差異蛋白篩選,其診斷模型由m/z2671.604、m/z5801.841、m/z8130.196、m/z9286.495組成,m/z5801.841、m/z8130.196、m/z9286.495在有效組中表達(dá)下調(diào),m/z2671.604在有效組中表達(dá)上調(diào)。結(jié)論:1.通過seldi-tof-ms技術(shù)及biomarkerwizard和biomarkerpattern軟件分別建立了ra早期診斷和診斷模型及ra-ss、ra-ild及ra-onph診斷模型,依據(jù)das28進(jìn)行疾病活動度分期,構(gòu)建疾病活動度診斷模型,血清學(xué)抗體陽性組與陰性組、抗ccp抗體陽性與陰性組及rf陽性與陰性組以及對益賽普組與mtx組、聯(lián)合lef與hcq組不同治療組間的差異蛋白篩選。2.初步探索益賽普治療前后ra患者血清差異蛋白,構(gòu)建預(yù)測生物療效的生物標(biāo)記物。3.上述診斷模型其敏感性與特異性均較高,且對ra診斷模型進(jìn)行了驗證。在繪制的ROC曲線中,進(jìn)一步驗證診斷模型具有一定的可靠性。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R593.22

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