本文關(guān)鍵詞：非天然氨基酸插入法構(gòu)建RANKL疫苗對(duì)小鼠膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎的治療

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【摘要】：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯穆匀碜陨砻庖咝约膊　Ｖ饕R床表現(xiàn)為小關(guān)節(jié)的滑膜炎所致的關(guān)節(jié)腫痛,繼而關(guān)節(jié)軟骨破壞、關(guān)節(jié)骨侵蝕,晚期因嚴(yán)重的骨質(zhì)破壞導(dǎo)致關(guān)節(jié)的僵直、畸形、功能喪失。全身骨量減少導(dǎo)致的病理性骨折是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎最嚴(yán)重的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)。慢性炎癥刺激的破骨細(xì)胞骨吸收活動(dòng)的過(guò)度增強(qiáng)是導(dǎo)致骨破壞的主要病理機(jī)制。OPG/RANKL-RANK信號(hào)通路是機(jī)體控制破骨細(xì)胞分化成熟和功能的關(guān)鍵信號(hào)通路,核因子kB受體活化因子配體(RANKL)通過(guò)與核因子kB受體活化因子結(jié)合后,通過(guò)經(jīng)典的絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路(MAPKs),PI3K/AKT和NFkB等信號(hào)通路來(lái)激活下游的破骨細(xì)胞相關(guān)基因,從而啟動(dòng)破骨細(xì)胞的分化與成熟。而骨保護(hù)素OPG作為RANKL的誘騙受體,競(jìng)爭(zhēng)性阻斷RANKL與RANK的結(jié)合來(lái)抑制破骨細(xì)胞的分化、成熟及骨吸收作用。近年來(lái)研究表明,抗RANKL抗體可以特異性阻斷RANKL與其受體RANK的結(jié)合,從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的上游阻斷破骨分化信號(hào)的發(fā)放,在骨質(zhì)疏松等破骨細(xì)胞骨吸收過(guò)強(qiáng)的疾病中起到了很好的治療作用。然而,單克隆抗體高昂的造價(jià)和安全性隱患限制了其廣泛的臨床應(yīng)用。相對(duì)于單克隆抗體,通過(guò)研制針對(duì)自體蛋白疫苗來(lái)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的多克隆抗體則顯得更為經(jīng)濟(jì)和安全。研究發(fā)現(xiàn),非天然氨基酸插入法是解決自體蛋白免疫耐受的新策略。通過(guò)在自體蛋白的特定位點(diǎn)插入非天然氨基酸,以增強(qiáng)自體蛋白的免疫原性,使自體免疫耐受被突破,從而產(chǎn)生高滴度的針對(duì)自體蛋白的多克隆抗體。本實(shí)驗(yàn)中利用非天然氨基酸插入法這一全新的技術(shù)對(duì)RANKL進(jìn)行特定位點(diǎn)的非天然氨基酸插入修飾,構(gòu)建非天然氨基酸替代的小鼠RANKL重組蛋白疫苗(pNO_2Phe~(240)mRANKL),并在小鼠膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型中檢測(cè)其療效與可行性,為進(jìn)一步優(yōu)化疫苗治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎奠定了基礎(chǔ)�！痉椒ê徒Y(jié)果】1、通過(guò)對(duì)pET28a-mRANKL重組表達(dá)載體進(jìn)行240位點(diǎn)p-硝基苯丙氨酸突變,構(gòu)建pET28a-pNO_2Phe~(240)mRANKL突變重組載體。通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)野生型和突變重組蛋白表達(dá)和純化。表達(dá)序列和蛋白分別通過(guò)雙向測(cè)序和質(zhì)譜分析鑒定。2、分別用pNO_2Phe~(240)mRANKL突變重組蛋白與野生型mRANKL蛋白免疫DBA1小鼠以檢測(cè)自身抗體誘導(dǎo)水平。在免疫結(jié)束后第7天,取小鼠血清,用ELISA檢測(cè)抗WT mRANKL和pNO_2Phe~(240)mRANKL的抗體滴度。結(jié)果表明抗血清具有較高的效價(jià)(1:6400)。3、驗(yàn)證p-硝基苯丙氨酸-RANKL重組疫苗對(duì)小鼠膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎的治療效應(yīng)。在疫苗蛋白免疫結(jié)束后的第7天開(kāi)始對(duì)DBA1小鼠尾部皮下注射II型膠原蛋白誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型。通過(guò)臨床關(guān)節(jié)炎評(píng)分,血清二型膠原抗體的滴度和組織病理切片等實(shí)驗(yàn)方法評(píng)估關(guān)節(jié)炎炎癥的程度;X線平片掃描技術(shù)和顯微CT技術(shù)檢測(cè)骨局部和全身骨侵蝕的程度。結(jié)果顯示突變重組蛋白對(duì)小鼠關(guān)節(jié)對(duì)骨侵蝕有明顯的治療效果,且在減輕關(guān)節(jié)炎表征上有一定的作用。【結(jié)論】本課題首次構(gòu)建了非天然氨基酸插替代的pNO_2Phe~(240)mRANKL重組蛋白疫苗并在小鼠膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型上驗(yàn)證其治療作用。對(duì)關(guān)節(jié)炎臨床表征和侵蝕的結(jié)果分析表明,非天然氨基酸突變疫苗免疫的小鼠的骨侵蝕程度被明顯的降低,同時(shí),關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)也有一定的降低,與預(yù)期相一致。為下一步疫苗的優(yōu)化和其機(jī)制的深入研究打下了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R593.22

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