本文關(guān)鍵詞：PMPs對RA-FLS遷移和侵襲的影響及機制探討

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【摘要】：目的：血小板微顆粒(PMPs)是血小板活化過程中形成的囊性小泡,含有細(xì)胞因子、白介素、趨化因子等多種生物活性物質(zhì)。研究顯示PMPs所具有的生物膜囊性結(jié)構(gòu),能夠協(xié)助這些生物活性物質(zhì)作用于靶細(xì)胞進而放大細(xì)胞間信號傳遞的級聯(lián)反應(yīng),因而與包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)在內(nèi)的多種炎性、自身免疫性疾病有關(guān)。有報道認(rèn)為PMPs夠加強多種腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力,而RA成纖維樣滑膜細(xì)胞(RA-FLS)遷移和侵襲能力的增強是RA關(guān)節(jié)破壞的重要環(huán)節(jié)。因此我們認(rèn)為PMPs有可能通過促進RA-FLS的遷移和侵襲,參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展。本研究的目的是觀察PMPs對人RA-FLS細(xì)胞株(MH7A)遷移和侵襲的影響,并初步探究PMPs調(diào)控RA-FLS遷移和侵襲的機制。方法：1、使用二磷酸腺苷(ADP)活化血小板,離心收集純化PMPs,并使用流式細(xì)胞儀以PE標(biāo)記的鼠抗人CD41抗體檢測所提取PMPs的純度。2、使用細(xì)胞劃痕實驗和Transwell細(xì)胞遷移實驗研究PMPs對RA-FLS遷移的影響。3、使用Transwell細(xì)胞侵襲實驗研究PMPs對RA-FLS侵襲的影響。4、使用RA-FLS與Ⅰ型膠原、人纖維連接蛋白和Matrigel進行細(xì)胞與ECM黏附實驗研究PMPs對RA-FLS與ECM黏附的影響。5、使用基因芯片高通量分析研究PMPs作用后RA-FLS表達譜的變化。使用RT-qPCR從mRNA水平檢測PMPs對基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)表達產(chǎn)生的影響。6、使用Western blot方法研究MMP1蛋白水平表達的變化,并檢測PMPs處理48小時后,RA-FLS中p-I-κB和p-NF-κB水平以及p-Erk和p-Akt水平的改變以探究PMPs激活NF-κB通路的可能途徑。結(jié)果：1、PMPs純度約為93.4%,可用于后續(xù)細(xì)胞水平的實驗。2、細(xì)胞劃痕實驗中25 μg/ml PMPs組RA-FLS的愈合速度快于對照組,50μg/ml PMPs組又快于25 μg/ml PMPs組。Transwell田胞遷移實驗顯示對照組每100倍視野下平均穿過29.6±4.5個細(xì)胞,25 μg/ml PMPs組穿過62.4±7.2個細(xì)胞,50 μg/ml PMPs組穿過175.1±10.6個細(xì)胞,實驗組與對照組存在統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。3、Transwell細(xì)胞侵襲實驗顯示對照組每100倍視野下平均穿過19.9±3.7個細(xì)胞,25 μg/ml PMPs組穿過39.2±6.9個細(xì)胞,50 μg/ml PMPs組穿過80.4±9.4個細(xì)胞,實驗組與對照組存在統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。4. PMPs促進RA-FLS與三種ECM模擬物(Ⅰ型膠原、人纖維連接蛋白和Matrigel)發(fā)生黏附,25 μg/ml PMPs組細(xì)胞對Ⅰ型膠原、人纖維連接蛋白和Matrigel的黏附率分別為對照組的1.08±0.09倍、1.17±0.10倍和1.08±0.10倍,其中人纖維連接蛋白有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。50 μg/ml PMPs組細(xì)胞對Ⅰ型膠原、人纖維連接蛋白和Matrigel的黏附率分別為對照組的1.25±0.12倍、1.31±0.13倍和1.19±0.12倍,三種ECM模擬物均有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。5、高通量基因芯片檢測顯示PMPs能夠影響RA-FLS多種基因的表達,富集分析結(jié)果顯示差異性表達的基因主要集中于ECM受體相互作用、局部黏附、細(xì)胞黏附分子、MAPK信號通路相關(guān)的多種基因�；蛐酒Y(jié)果顯示PMPs組中MMP1的表達量高于對照組。隨后的RT-qPCR結(jié)果證實25μg/ml PMPs組中MMP1表達量高于對照組,而MMP2的表達不存在明顯差異。6、Western blot結(jié)果顯示25 μg/ml PMPs組相較于對照組,MMP1表達量,p-IκB水平,p-NF-κB水平和p-Erk水平均上調(diào)(P0.05)。50 μg/ml PMPs組中MMP1,p-IκB水平,p-NF-κB水平和p-Erk水平表達量的上調(diào)更為明顯(P0.05)。而MMP2和p-Akt水平在各組間變化不明顯。結(jié)論：PMPs可能通過Erk磷酸化而活化NF-κB通路,上調(diào)MMP1表達,促進人RA-FLS與ECM黏附,促進細(xì)胞的遷移和侵襲。
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R593.2

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本文編號：1172655