本文關(guān)鍵詞：骨橋蛋白介導(dǎo)甲狀腺相關(guān)眼病發(fā)病機(jī)制的研究

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【摘要】：研究目的甲狀腺相關(guān)眼病(thyroid associated ophthalmopathy,TAO)是彌漫性毒性甲狀腺腫(Graves’disease,GD)最常見的甲狀腺外表現(xiàn),是累及眼眶的一種自身免疫性炎癥性疾病。TAO具體發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,至今仍不十分清楚,目前仍缺乏有效性治療手段。目前證據(jù)表明眼眶成纖維細(xì)胞(orbital fibroblasts,OFs)在TAO發(fā)病機(jī)制中起核心作用,參與TAO眼眶炎癥、組織重塑和纖維化等多種病理過程。骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)是一種分泌型磷酸化糖蛋白,在一些自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用,具有多種生物學(xué)效應(yīng),可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖,并且和組織纖維化有密切關(guān)系,最近研究發(fā)現(xiàn),GD患者血清中OPN水平明顯增高。為了探究OPN和TAO發(fā)病的關(guān)系,首先擬檢測TAO眼眶脂肪結(jié)締組織中OPN mRNA和蛋白表達(dá)情況,相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)情況以及和OPN mRNA表達(dá)量之間的關(guān)系。然后進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn),用OPN刺激TAO患者來源OFs,觀察OPN對OFs增殖、移行以及對VEGF和CollagenⅠmRNA表達(dá)量的影響并探究其相關(guān)機(jī)制。研究方法1.OPN在TAO患者眼眶脂肪結(jié)締組織中的表達(dá)情況活動期或穩(wěn)定期TAO患者行眼眶減壓手術(shù)時,取眼眶脂肪結(jié)締組織,用行眼整形手術(shù)患者的正常眼眶脂肪結(jié)締組織作為對照組,每組6例。實(shí)時熒光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)法和Western blotting法分別檢測OPN mRNA和蛋白表達(dá)情況。然后通過RT-PCR檢測相關(guān)細(xì)胞因子包括CD40L、CollagenⅠ、HAS2、NF-κB、CCL20、CD44、IFN-α和IFN-γmRNA表達(dá)情況,并和OPN mRNA表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析。2.OPN對TAO患者OFs的影響及其作用機(jī)制探討排除其它免疫性及炎癥性疾病的TAO患者,行眼眶減壓手術(shù)時,無菌條件下取眼眶脂肪結(jié)締組織,組織塊法培養(yǎng)OFs細(xì)胞。用OPN(5uM)進(jìn)行預(yù)處理后,采用MTT法觀察OFs增殖速率,并通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察OPN對OFs移行的影響,再通過RT-PCR法檢測OFs的VEGF和CollagenⅠmRNA表達(dá)量。同法培養(yǎng)OFs細(xì)胞,用PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002(20uM)、MAPK/ERK信號通路抑制劑PD98059(20uM)、LY294002和PD98059(20uM+20uM)以及OPN單克隆抗體1A12(20μg/ml)分別聯(lián)合OPN對OFs進(jìn)行預(yù)處理,通過MTT法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和RT-PCR法分別觀察對OFs增殖、移行速率的影響,并檢測OFs的VEGF和CollagenⅠmRNA表達(dá)量的變化。結(jié)果1.活動期TAO患者眼眶脂肪結(jié)締組織OPN mRNA和蛋白表達(dá)量及相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量升高活動期TAO患者組眼眶脂肪結(jié)締組織中OPN mRNA比穩(wěn)定期TAO患者組和正常對照組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);OPN蛋白表達(dá)量也明顯增加,和穩(wěn)定期TAO患者OPN蛋白表達(dá)量相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但和正常對照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)�；顒悠赥AO患者組眼眶脂肪結(jié)締組織中CD40L、CollagenⅠmRNA表達(dá)量比穩(wěn)定期TAO患者組和正常對照組高,存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);HAS2 mRNA表達(dá)量也升高,但和穩(wěn)定期TAO患者組和正常對照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);活動期和穩(wěn)定期TAO患者組CD44 mRNA表達(dá)量均低于正常對照(P0.05)。TAO患者OPN mRNA表達(dá)量和CD40L、CD44、HAS2 mRNA表達(dá)量之間存在明顯的線性相關(guān)關(guān)系(P0.05)。2.OPN可促進(jìn)OFs的增殖、移行速率,并增加VEGF和CollagenⅠmRNA表達(dá)量。經(jīng)過OPN處理后,OFs增殖和移行速率加快,加入1A12和LY294002后,OFs增殖和移行速率變慢,而加入PD98059后對這些效應(yīng)無明顯影響。經(jīng)OPN預(yù)處理后,OFs的VEGF和CollagenⅠmRNA表達(dá)量明顯增加,加入1A12和LY294002后,VEGF和CollagenⅠmRNA表達(dá)量降低,加入PD98059后對兩種基因mRNA表達(dá)量無明顯影響。結(jié)論活動期TAO患者眼眶脂肪結(jié)締組織OPN mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高,同時CD40L、CollagenⅠ和HAS2 mRNA表達(dá)量也增加,且CD40L、CD44、HAS2mRNA表達(dá)量和OPN mRNA表達(dá)量之間呈明顯的線性相關(guān)關(guān)系。OPN可以通過PI3K/Akt信號通路促進(jìn)OFs增殖和移行,刺激OFs高表達(dá)CollagenⅠ和VEGF mRNA,說明OPN可能在活動期TAO發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用,通過PI3K/Akt信號通路,協(xié)同CD40L、HAS2活化OFs以促進(jìn)眼眶炎癥的發(fā)生發(fā)展以及眼眶組織重塑和纖維化。
【關(guān)鍵詞】：骨橋蛋白 甲狀腺相關(guān)眼病 眼眶脂肪結(jié)締組織 眼眶成纖維細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R581;R771.3
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 縮略詞表10-11
• 前言11-13
• 第一部分 骨橋蛋白在TAO眼眶脂肪結(jié)締組織中的表達(dá)13-27
• 一、材料與方法13-19
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果19-24
• 三、討論24-27
• 第二部分 骨橋蛋白對TAO眼眶成纖維細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制研究27-39
• 一、材料與方法27-32
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-36
• 三、討論36-39
• 全文總結(jié)39-40
• 參考文獻(xiàn)40-48
• 綜述48-60
• 參考文獻(xiàn)52-60
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明60-61
• 致謝61

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