發(fā)布時間：2017-10-30 12:17

  本文關(guān)鍵詞：外周血單個核細(xì)胞中風(fēng)濕病相關(guān)基因的鑒定與評價

  更多相關(guān)文章： 外周血單個核細(xì)胞 風(fēng)濕病 共同遺傳因素

【摘要】：研究背景風(fēng)濕病是一組以肌肉、關(guān)節(jié)疼痛為主要特征的疾病,大多數(shù)風(fēng)濕病的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明了,不同種類的風(fēng)濕病患者具有某些相同的癥狀,這一現(xiàn)象提示各種風(fēng)濕病間可能存在相同的病理機(jī)制。已有研究表明遺傳因素在風(fēng)濕病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。目前,基因差異表達(dá)分析已廣泛應(yīng)用于各種類型的風(fēng)濕病,鑒定出了大量的風(fēng)濕病相關(guān)基因,并且發(fā)現(xiàn)不同種類的風(fēng)濕病存在相同的遺傳因素。然而,目前國內(nèi)外針對風(fēng)濕病共同遺傳因素的研究較少,且多數(shù)研究納入的風(fēng)濕病種類少,因此還需要更多更系統(tǒng)的研究來探討風(fēng)濕病的共同遺傳因素,從分子水平為風(fēng)濕病的共同機(jī)制研究提供線索。研究目的1.從人類外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中鑒定不同風(fēng)濕病的共同差異表達(dá)基因,并探討其相互作用及生物學(xué)功能;2.收集風(fēng)濕病患者及未患有任何風(fēng)濕病的對照樣本,驗(yàn)證所鑒定的基因,并比較分析它們判別風(fēng)濕病患者和非風(fēng)濕病對照的能力;3.對于經(jīng)驗(yàn)證的基因,進(jìn)一步鑒定相關(guān)的表觀遺傳調(diào)控因子。材料與方法1.從PubMed和基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(Gene expression Ominibus,GEO)搜索獲得風(fēng)濕病相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集,搜索范圍包括23種臨床常見的風(fēng)濕性疾病。2.公共數(shù)據(jù)庫來源的數(shù)據(jù)處理分析方法:采用R軟件的MetaDE軟件包進(jìn)行各基因表達(dá)數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)預(yù)處理和分析�；虿町惐磉_(dá)分析采用t檢驗(yàn),用BenjaminiHochberg FDR法進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正。采用STRING 9.1進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析,用AmiGo 2進(jìn)行基因功能富集分析。3.重復(fù)驗(yàn)證樣本:本研究共納入27例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)患者及18例未診斷為任何風(fēng)濕病的對照。RA患者來自蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科門診,對照來自蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部。每位志愿者捐獻(xiàn)10ml外周血用于芯片實(shí)驗(yàn)。4.由培訓(xùn)合格的調(diào)查員收集RA患者及對照的一般人口統(tǒng)計學(xué)資料、生活方式、既往病史及現(xiàn)病史,以及ra患者的c反應(yīng)蛋白、關(guān)節(jié)腫脹和壓痛數(shù)等疾病相關(guān)信息。由專業(yè)醫(yī)務(wù)人員采集研究對象的外周血,由經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)人員用淋巴細(xì)胞分離液提取pbmcs進(jìn)行芯片實(shí)驗(yàn)。mrna、mirna和dna甲基化水平分別采用agilentlncrnamrnamicroarray、affymetrixmirna4.0和illumina450kdna甲基化芯片檢測。5.應(yīng)用spss21進(jìn)行統(tǒng)計分析,基因差異表達(dá)分析采用雙側(cè)t檢驗(yàn)。用medcalc軟件繪制roc曲線并比較分析各基因判別ra和對照的效能。采用tarbase數(shù)據(jù)庫和targetscan軟件獲得調(diào)控基因表達(dá)的候選mirna,用pearson’s相關(guān)分析mirna與mrna表達(dá)水平的關(guān)聯(lián),以及mrna與dna甲基化水平的關(guān)聯(lián)。用cytoscape軟件繪制基因、mirna和dna甲基化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究結(jié)果1.從geo數(shù)據(jù)庫篩選獲得6個風(fēng)濕病相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集,包括4種常見的風(fēng)濕病:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、骨關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎。另外,本研究還納入了27例處于病情活動期的ra患者及18例非風(fēng)濕病對照,均為女性。ra患者的平均年齡為47.33±10.91歲,非風(fēng)濕病對照組的平均年齡為47.11±14.09歲。兩組研究對象年齡差別無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.06,p=0.953)。2.通過基因差異表達(dá)分析鑒定出八個基因(tnfsf10、cx3cr1、ly96、tlr5、txn、tia1、prkch、prf1),每個基因至少在所納入的4種風(fēng)濕病中的3種中有差異表達(dá)。3.通過蛋白質(zhì)相互作用分析發(fā)現(xiàn)所鑒定的八個基因存在廣泛的文本關(guān)聯(lián),有三對基因存在共表達(dá)關(guān)系:cx3cr1/pf1、tlr5/tnfsf10和tnfsf10/prkch。在整個關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中,基因cx3cr1、prf1、tlr5和tnfsf10作為網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)將八個基因聯(lián)系在一起。4.對所鑒定的八個基因的功能富集分析結(jié)果顯示它們主要富集于免疫相關(guān)的生物學(xué)過程,包括細(xì)胞防御反應(yīng)、機(jī)體對細(xì)菌和細(xì)菌相關(guān)物質(zhì)的反應(yīng)等。5.在新的人群中的驗(yàn)證結(jié)果顯示,tnfsf10、txn、tlr5和tia1的表達(dá)量為ra病例組高于對照組(p0.05);ly96、prkch、cx3cr1和prf1的表達(dá)量在兩組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。6.應(yīng)用roc曲線分析tnfsf10、txn、tlr5和tia1區(qū)分ra和對照的效能,其auc分別為0.882(95%ci:0.750-0.959)、0.835(95%ci:0.695-0.929)、0.817(95%CI:0.673-0.916)、0.689(95%CI:0.534-0.819),四個基因聯(lián)合應(yīng)用時AUC為0.909(95%CI:0.786-0.974)。AUC最大的基因?yàn)門NFSF10,它與TXN和TLR5的AUC差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),與AUC最小的基因TIA1的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。四個基因聯(lián)合應(yīng)用時的ROC曲線下面積大于各個基因單獨(dú)作用,但是只與基因TIA1的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。7.對于TNFSF10、TXN、TLR5和TIA1,本研究共鑒定出56對負(fù)相關(guān)的miRNA-靶基因,調(diào)控各基因的miRNA數(shù)量分別為7、2、17和31。其中,hsa-miR-4443和hsa-miR-142-5p均同時調(diào)控TIA1、TLR5和TNFSF10三個基因。Hsa-miR-3609調(diào)控TIA1、TXN和TLR5。Hsa-miR-342-3p和hsa-miR-3185均同時調(diào)控基因TIA1和TLR5。8.TLR5的表達(dá)水平與其5’非翻譯區(qū)的甲基化位點(diǎn)cg17938489的甲基化水平呈正相關(guān)。TNFSF10的表達(dá)水平與其Body區(qū)的cg01059398和TSS1500區(qū)的cg22572614的甲基化水平呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論1.不同類型的風(fēng)濕病之間存在共同的遺傳因素,本研究針對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強(qiáng)直性脊柱炎和骨關(guān)節(jié)炎共鑒定出8個共同差異表達(dá)基因。八個基因主要富集于免疫相關(guān)的生物學(xué)過程。2.所鑒定的8個基因中有4個在RA患者PBMCs中得到驗(yàn)證,它們均有一定的區(qū)分RA患者和非風(fēng)濕病對照的能力。其中TNFSF10在病例和對照中差異表達(dá)較顯著,且判別病例和對照的能力較強(qiáng)。3.經(jīng)驗(yàn)證的四個基因與相關(guān)的48個miRNA和3個甲基化位點(diǎn)可能在RA的發(fā)病中發(fā)揮作用。4.對于本研究鑒定的8個風(fēng)濕病共同差異表達(dá)基因,還需要在更大樣本量、更多種類的風(fēng)濕病患者中進(jìn)行驗(yàn)證,針對所驗(yàn)證的基因進(jìn)行深入研究,探討風(fēng)濕病的共同機(jī)制,可以為風(fēng)濕病的預(yù)防、診斷以及治療提供線索和依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：外周血單個核細(xì)胞 風(fēng)濕病 共同遺傳因素
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R593.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 引言13-16
• 材料與方法16-21
• 1 公共數(shù)據(jù)庫來源的風(fēng)濕病相關(guān)基因表達(dá)譜16-17
• 2 數(shù)據(jù)預(yù)處理及分析方法17
• 2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理17
• 2.2 鑒定不同風(fēng)濕病的共同差異表達(dá)基因17
• 3 蛋白質(zhì)相互作用分析17-18
• 4 基因功能富集分析18
• 5 RA患者及非風(fēng)濕病對照樣本的收集18-19
• 6 mRNA、miRNA和DNA甲基化芯片實(shí)驗(yàn)19
• 7 在RA病例及非風(fēng)濕病對照中驗(yàn)證所鑒定的基因19
• 8 鑒定調(diào)控基因表達(dá)的miRNA19-20
• 9 鑒定調(diào)控基因表達(dá)的DNA甲基化位點(diǎn)20-21
• 結(jié)果21-33
• 一、風(fēng)濕病相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集21
• 二、風(fēng)濕病共同差異表達(dá)基因鑒定結(jié)果21-22
• 三、蛋白質(zhì)相互作用分析結(jié)果22-23
• 四、功能富集分析結(jié)果23-25
• 五、納入研究的RA患者和非風(fēng)濕病對照的一般情況及基因驗(yàn)證結(jié)果25-28
• 六、比較分析基因判別RA患者和對照的效能28-29
• 八、調(diào)控基因表達(dá)的miRNA29-31
• 九、調(diào)控基因表達(dá)的DNA甲基化位點(diǎn)31-33
• 討論33-36
• 參考文獻(xiàn)36-42
• 綜述：四種常見風(fēng)濕性疾病易感基因的研究進(jìn)展42-56
• 參考文獻(xiàn)48-56
• 縮寫詞和中英文對照56-58
• 攻讀碩士學(xué)位期間公開發(fā)表的論文58-59
• 附表 1 RA患者一般情況及疾病活動度相關(guān)指標(biāo)59-60
• 附表 2 TarBase來源的miRNA-靶基因相關(guān)分析結(jié)果60-62
• 附表 3 TargetScan預(yù)測結(jié)果及miRNA-mRNA相關(guān)分析結(jié)果62-74
• 附表 4 基因表達(dá)與DNA甲基化水平的相關(guān)分析結(jié)果74-76
• 致謝76-77

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