發(fā)布時(shí)間：2017-10-24 02:13

  本文關(guān)鍵詞：NFATc1過表達(dá)對(duì)唑來膦酸誘發(fā)的破骨細(xì)胞抑制的挽救效應(yīng)

  更多相關(guān)文章： 唑來膦酸 破骨細(xì)胞 活化T細(xì)胞核因子蛋白c1 基因重組

【摘要】：目的本研究利用細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(Ligand of receptor activator of nuclear factorκB,RANKL)誘導(dǎo)小鼠白血病單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系向破骨細(xì)胞分化。在此過程中加入第三代雙膦酸鹽—唑來膦酸,探索唑來膦酸對(duì)破骨細(xì)胞生成的抑制作用和對(duì)破骨細(xì)胞的主要調(diào)節(jié)因子活化T細(xì)胞核因子蛋白c1(nuclear factor of activated T cells type c1,NFATc1)及其下游因子表達(dá)的影響;利用慢病毒載體構(gòu)建鼠源NFATc1重組載體、人源結(jié)構(gòu)活性NFATc1重組載體,證實(shí)NFATc1過表達(dá)對(duì)唑來膦酸誘發(fā)的破骨細(xì)胞抑制的挽救效應(yīng)。方法1建立小鼠白血病單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系體外培養(yǎng)體系;將細(xì)胞分為2組:A組為對(duì)照組,B組為唑來膦酸處理組;兩組細(xì)胞用50ng/ml RANKL誘導(dǎo)5天,并且第2天在B組中加入1×10-6mmol/ml唑來膦酸作用兩天。在第6天收獲兩組細(xì)胞,通過抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色和牙本質(zhì)陷窩檢測(cè)破骨細(xì)胞的生成和骨吸收功能。NFATc1、TRAP、c-Src的蛋白表達(dá)和m RNA水平則通過Western-Blot、免疫熒光化學(xué)和Real-time PCR檢測(cè)。2利用慢病毒構(gòu)建鼠源NFATc1重組載體和人源結(jié)構(gòu)活性的NFATc1(constructive active NFATc1,ca-NFATc1)重組載體,并且利用陰性載體慢病毒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞確定轉(zhuǎn)染時(shí)的最佳MOI值。隨后應(yīng)用NFATc1重組載體轉(zhuǎn)染RAW274.7細(xì)胞,NFATc1過表達(dá)的蛋白表達(dá)量和m RNA水平分別通過WesternBlot、Real-time PCR檢測(cè)。3將RAW264.7細(xì)胞分為三組:其中A組為對(duì)照組;B組為陰性載體轉(zhuǎn)染組;C組為NFATc1重組載體轉(zhuǎn)染組。三組細(xì)胞應(yīng)用與上述相同的處理方法,RANKL和唑來膦酸作用5天。第六天收獲3組細(xì)胞,進(jìn)行如下檢測(cè):TRAP染色、Western-Blot、Real-time PCR、免疫熒光化學(xué)及牙本質(zhì)吸收陷窩,以此來證實(shí)NFATc1過表達(dá)對(duì)唑來膦酸誘發(fā)的破骨細(xì)胞抑制的挽救效應(yīng)。結(jié)果1成功構(gòu)建RAW264.7細(xì)胞系體外培養(yǎng)體系。經(jīng)RANKL和唑來膦酸處理后,A、B兩組細(xì)胞中均出現(xiàn)多核破骨細(xì)胞;其中B組(唑來膦酸處理組)中破骨細(xì)胞數(shù)目、骨吸收陷窩數(shù)目及骨吸收陷窩面積分別為24.5±2.1、22.3±3.1和5746.0±786.6mm2,均顯著低于A組中55.0±3.0、32.7±2.5和9054.7±182.5mm2(P0.05)。經(jīng)Western-Blot檢測(cè),B組中NFATc1、TRAP、c-Src的蛋白表達(dá)顯著低于A組(P0.05),分別下降了44.1%、37.9%和35.8%;經(jīng)Real-time PCR檢測(cè),B組中3種基因的m RNA水平較A組也顯著降低,分別下降了50.5%、49.5%、45.5%(P0.05);免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)也得到與上述相似的結(jié)果,B組中NFATc1、TRAP、c-Src的蛋白表達(dá)明顯低于A組。上述結(jié)果提示,唑來膦酸對(duì)破骨細(xì)胞的生成起到抑制作用,并且能夠下調(diào)破骨細(xì)胞相關(guān)基因(NFATc1、TRAP、c-Src)的表達(dá)。2委托上海吉?jiǎng)P基因有限公司成功構(gòu)建鼠源NFATc1重組載體和人源ca-NFATc1重組載體。轉(zhuǎn)染時(shí)最佳的MOI值為30,此時(shí)能夠獲得較高的轉(zhuǎn)染效率,細(xì)胞能有較高的活性以及增殖能力。鼠源NFATc1重組載體:經(jīng)Western-Blot檢測(cè),C組NFATc1、TRAP蛋白表達(dá)量較A組中升高了178.6%、127.8%(P0.01);經(jīng)Real-time PCR檢測(cè),C組NFATc1、TRAP m RNA水平較A組中也升高了41.9%、33.6%(P0.05);B組中NFATc1的蛋白表達(dá)量和m RNA水平與A組無明顯差別(P0.05)。轉(zhuǎn)染人源ca-NFATc1重組載體后也得到與鼠源組相似的結(jié)果。3盡管三組同樣應(yīng)用RANKL和唑來膦酸處理,。C組中TRAP陽性破骨細(xì)胞的數(shù)目、牙本質(zhì)吸收陷窩數(shù)和吸收陷窩的面積分別是71.0±4.6、42.3±1.5和11863.7±968.1mm2明顯高于A組(27.0±1.0、23.0±1.7和6024.0±270.8mm2)(P0.01)。轉(zhuǎn)染鼠源NFATc1的C組中NFATc1、TRAP、cSrc的蛋白表達(dá)量經(jīng)Western-Blot檢測(cè)與A組相分別上升了92.0%、90.2%和122.0%(P0.01);Real-time PCR檢測(cè)顯示,C組NFATc1、TRAP、c-Src m RNA水平較A組分別升高了70.2%、71.7%和69.2%(P0.01)。然而,B組中以上參數(shù)與A組無明顯區(qū)別(P0.05)。轉(zhuǎn)染人源ca-NFATc1重組載體后NFATc1、TRAP、c-Src的蛋白表達(dá)量和m RNA水平亦獲得與以上相似的結(jié)果。以上結(jié)果均提示,外源性NFATc1過表達(dá)能夠在一定程度上對(duì)唑來膦酸誘發(fā)的破骨細(xì)胞生成的抑制和一些破骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的抑制產(chǎn)生挽救效應(yīng)。結(jié)論唑來膦酸能夠抑制RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化,并且抑制NFATc1、TRAP和c-Src等破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá);成功構(gòu)建NFATc1過表達(dá)重組載體,并促進(jìn)了下游因子TRAP的表達(dá);NFATc1過表達(dá)對(duì)唑來膦酸誘發(fā)的破骨細(xì)胞生成、骨吸收功能及NFATc1、TRAP、c-Src基因表達(dá)的抑制產(chǎn)生挽救效應(yīng)。NFATc1作為Ca2+信號(hào)軸的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子和破骨細(xì)胞分化主要調(diào)節(jié)基因,在唑來膦酸對(duì)破骨細(xì)胞的生成抑制中起到關(guān)鍵作用。
【關(guān)鍵詞】：唑來膦酸 破骨細(xì)胞 活化T細(xì)胞核因子蛋白c1 基因重組
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R580
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文縮略表10-11
• 引言11-13
• 第1章 實(shí)驗(yàn)研究13-55
• 1.1 材料13-14
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象13
• 1.1.2 儀器和設(shè)備13
• 1.1.3 試劑和藥物13-14
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法14-27
• 1.2.1 小鼠RAW264.7 細(xì)胞的培養(yǎng)14-15
• 1.2.2 唑來膦酸對(duì)破骨細(xì)胞生成、功能及NFATc1、TRAP、c-Src表達(dá)的影響15-23
• 1.2.3 NFATc1過表達(dá)重組載體構(gòu)建23-26
• 1.2.4 NFATc1過表達(dá)對(duì)唑來膦酸誘發(fā)的破骨細(xì)胞生成、功能及NFATc1、TRAP、c-Src表達(dá)抑制的影響26-27
• 1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析27
• 1.3 結(jié)果27-48
• 1.3.1 小鼠RAW264.7 細(xì)胞的培養(yǎng)27-28
• 1.3.2 唑來膦酸對(duì)破骨細(xì)胞生成及NFATc1、TRAP、c-Src表達(dá)的影響28-32
• 1.3.3 NFATc1過表達(dá)重組載體構(gòu)建32-40
• 1.3.4 NFATc1過表達(dá)對(duì)唑來膦酸誘發(fā)的破骨細(xì)胞生成、功能及NFATc1、TRAP、c-Src表達(dá)抑制的影響40-48
• 1.4 討論48-51
• 1.4.1 唑來膦酸對(duì)破骨細(xì)胞抑制的分子機(jī)制48
• 1.4.2 唑來膦酸對(duì)破骨細(xì)胞形成及NFATc1、TRAP、c-Src表達(dá)的影響48-50
• 1.4.3 NFATc1過表達(dá)對(duì)唑來膦酸誘發(fā)的破骨細(xì)胞抑制的影響50-51
• 1.5 小結(jié)51
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 第2章 綜述 NFATc1在破骨細(xì)胞分化過程中的重要作用55-61
• 2.1 破骨細(xì)胞55
• 2.2 唑來膦酸對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用55-56
• 2.3 Ca2+/Calmodulin/ NFATc1信號(hào)途徑56-57
• 2.4 活化T細(xì)胞核因子蛋白（nuclear factor of activated T cells，NFAT）57-58
• 2.4.1 NFAT的生物學(xué)特性和分類57
• 2.4.2 NFATc1在破骨細(xì)胞分化中的重要作用57-58
• 參考文獻(xiàn)58-61
• 結(jié)論61-62
• 附錄A 鼠源NFATc1重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果62-64
• 附錄B 人源ca-NFATc1重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果64-66
• 致謝66-67
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介67-68
• 作者簡(jiǎn)介68-69
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集69

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本文編號(hào)：1086535