本文關(guān)鍵詞：mTOR信號通路在糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞損傷中的研究

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【摘要】：目的:通過阻斷哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin mTOR)信號通路對糖尿病腎病(diabetic nephropathy DN)大鼠足細(xì)胞Ezrin、α-SMA蛋白及外周血Th17/Treg細(xì)胞的研究,探討mTOR通路對DN足細(xì)胞骨架蛋白和肌動蛋白合成的影響及Th17/Treg是否通過mTOR信號通路調(diào)控足細(xì)胞相關(guān)蛋白,為DN的治療提供新的靶點。方法:(1)模型的建立、分組:40只SD雄性大鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機(jī)分為2組:正常組(A組)10只,模型組30只;模型組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin STZ),劑量為55mg/Kg,3天后用血糖儀測血糖,以隨機(jī)血糖值≥16.7mmol/L且穩(wěn)定5天為DN造模成功;若未達(dá)標(biāo),另追加50mg/kg STZ,并在追加后3天后復(fù)測血糖。成功模型組隨機(jī)分為DN組(B組)、DN+他克莫司(tacrolimus FK506)干預(yù)組(C組)、DN+ku0063794干預(yù)組(D組)各10只;C、D組每天分別予FK506 1mg/kg/d、ku0063794 1mg/kg/d灌胃,A組、B組分別予以等量生理鹽水灌胃。實驗0周、4周、8周分別檢測A、B、C、D四組大鼠體重、血糖、血肌酐、尿肌酐、24小時尿蛋白定量,ELISA檢測各組大鼠外周血IL-17、TGF-β1因子,流式細(xì)胞學(xué)檢測CD4+CD25high Treg細(xì)胞占CD4+T百分比率;4、8周時處死各組一半大鼠取腎組織利用RT-PCR檢測Ezrin-mRNA、α-SMA-mRNA及Western blotting檢測mTOR、Raptor、Rictor、Ezrin、α-SMA蛋白。結(jié)果:(1)生化指標(biāo)(1)24h尿蛋白定量,組間比較:0周時,B組、C組、D組較A組明顯升高(P0.01),B組、C組、D組間無統(tǒng)計學(xué)差異;4周時,B組、C組、D組較A組明顯升高(P0.01),C組、D組低于B組(P0.05),D組與C組無統(tǒng)計學(xué)差異;8周時,B組明顯高于A組(P0.001),C組、D組明顯低于B組(P0.001),A組、C組、D組無統(tǒng)計學(xué)差異。組內(nèi)比較:B組8周明顯高于0周(P0.05);C組、D組8周明顯低于0周(P0.05)。(2)Ccr,組間比較:4周時,B組較A組下降(P0.05),D組高于B組(P0.05),c組與b組、d組無統(tǒng)計學(xué)差異;8周時,b組較a組明顯下降(p0.05),c組、d組明顯高于b組(p0.05),d組與c組無統(tǒng)計學(xué)差異。組內(nèi)比較無統(tǒng)計學(xué)差異。(2)westernblotting指標(biāo):(1)mtor蛋白,組間比較:4周時,b組、c組、d組較a組升高(p0.05),c組低于b組(p0.05),d組與b組、c組無統(tǒng)計學(xué)差異;8周時,b組較a組明顯升高(p0.05),c組、d組明顯低于b組(p0.001),a組、c組、d組無統(tǒng)計學(xué)差異。組內(nèi)比較無統(tǒng)計學(xué)差異。(2)raptor蛋白,組間比較:4周、8周時,b組、c組、d組較a組升高(p0.05),c組、d組明顯低于b組(p0.05),d組與c組無統(tǒng)計學(xué)差異。組內(nèi)比較:c組8周低于4周(p0.05)。(3)rictor蛋白,組間比較:4周時,b組、c組、d組較a組升高(p0.05),c組、d組較b組明顯降低(p0.05),d組與c組無統(tǒng)計學(xué)差異差異;8周時,b組較a組明顯升高(p0.001),c組、d組明顯低于b組(p0.001),a組、c組、d組間無統(tǒng)計學(xué)差異。組內(nèi)比較無統(tǒng)計學(xué)差異。(4)ezrin蛋白,組間比較:4周時,b組、c組、d組較a組降低(p0.05),c組、d組高于b組(p0.05),d組與c組無統(tǒng)計學(xué)差異;8周時,b組較a組明顯降低(p0.05),c組、d組明顯高于b組(p0.05),a組、c組、d組間無統(tǒng)計學(xué)差異。組間比較:b組8周低于4周(p0.05)。(5)α-sma蛋白,組間比較:4周時,b組、c組、d組較a組升高(p0.05),c組、d組低于b組(p0.05),d組與c組無統(tǒng)計差異;8周時,b組、c組、d組較a組升高(p0.05),c組、d組明顯低于b組(p0.05),d組低于c組(p0.05)。組內(nèi)比較:b組8周高于4周(p0.05);c組、d組8周均低于4周(p0.05)。(3)rt-pcr指標(biāo):(1)ezrin-mrna,組間比較:4、8周時,b組、c組、d組較a組降低(p0.05),c組、d組高于b組p0.05),c組與d組無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。組內(nèi)比較無統(tǒng)計學(xué)差異。(2)α-sma-mrna,組間比較:4周時,b組、c組、d組較a組升高(p0.05),c組、d組明顯低于b組(p0.001),d組與c組無統(tǒng)計學(xué)差異;8周時,b組、c組較a組升高(p0.05),c組、d組明顯低于b組(p0.001),d組與a組、c組無統(tǒng)計學(xué)差異。組內(nèi)比較無統(tǒng)計學(xué)差異。(4)流式細(xì)胞學(xué)指標(biāo):cd4+cd25hightreg百分比,組間比較:4周、8周時,b組較a組明顯降低(p0.05),c、d高于b組(p0.05),a組、c組、d組間無統(tǒng)計學(xué)差異。組內(nèi)比較:b組8周、4周較0周明顯降低(p0.001);D組4周高于8周(P0.05)。(5)ELISA指標(biāo):(1)TGF-β1,組間比較:4周時,B組、D組較A組升高(P0.05),D組低于B組(P0.05),C組與A組、B組、D組無統(tǒng)計學(xué)差異;8周時,B組較A組明顯升高(P0.05),C組、D組均與A組、B組無統(tǒng)計學(xué)差異,D組高于C組(P0.001)。組內(nèi)比較:B組、C組、D組4周、8周均高于0周(P0.05),D組8周高于4周(P0.05)。(2)IL-17,組間比較:4周時,B組、C組較A組升高(P0.05),C組、D組低于B組(P0.05),D組與A組、C組無統(tǒng)計學(xué)差異;8周時,B組、C組較A組升高(P0.05),C組與B組無統(tǒng)計學(xué)差異,D組與A組、B組、C組無統(tǒng)計學(xué)差異。組內(nèi)比較:A組8周高于0周(P0.05);B組、C組、D組4周、8周明顯高于0周(P0.05)。(6)相關(guān)性分析:(1)B組大鼠4周時,Rictor與與α-SMA-mRNA呈正相關(guān),與Ezrin、Ezrin-mRNA呈負(fù)相關(guān);8周時,Rictor與α-SMA、TGF-β1、IL-17呈正相關(guān),與Ezrin、CD4+CD25high Treg呈負(fù)相關(guān);Raptor與Ezrin、Ezrin-mRNA、α-SMA、α-SMA-mRNA、CD4+CD25high Treg、TGF-β1、IL-17無相關(guān)。(2)B組大鼠4周、8周時,CD4+CD25high Treg與TGF-β1蛋白呈均負(fù)相關(guān)。(3)B組大鼠4周、8周Ezrin-mRNA與CD4+CD25high Treg均呈正相關(guān);8周時,Ezrin、Ezrin-mRNA與TGF-β1、IL-17負(fù)相關(guān);(4)B組大鼠4周時,α-SMA-mRNA與IL-17呈正相關(guān),與CD4+CD25high Treg負(fù)相關(guān)。結(jié)論:1、阻斷mTOR通路DN大鼠腎臟能升高腎小球濾過率、降低尿蛋白、改善大鼠精神狀態(tài)。2、mTORC2信號通路參與了DN的足細(xì)胞的Ezrin、α-SMA蛋白的表達(dá)。3、Treg可能通過mTORC2信號通路調(diào)控Ezrin、α-SMA蛋白的合成。4、FK506也可同時阻斷mTORC1、mTORC2信號通路。
【關(guān)鍵詞】：糖尿病腎病 mTOR信號通路 足細(xì)胞蛋白 Th17/Treg
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R692.9
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-13
• 中英文縮略詞表13-14
• 第1章 引言14-17
• 第2章 材料和方法17-28
• 2.1 試驗材料17-19
• 2.1.1 動物實驗17
• 2.1.2 材料17-19
• 2.2 試驗方法19-27
• 2.2.1 DN動物模型的建立19
• 2.2.2 DN動物模型的分組19
• 2.2.3 標(biāo)本的收集19-20
• 2.2.4 各項指標(biāo)檢測20-27
• 2.3 統(tǒng)計學(xué)處理27-28
• 第3章 實驗結(jié)果28-52
• 3.1 各組大鼠的一般情況比較28
• 3.2 大鼠的體重及生化參數(shù)28-33
• 3.2.1 大鼠體重28-29
• 3.2.2 大鼠血糖29-30
• 3.2.3 大鼠 24h 尿蛋白30-31
• 3.2.4 大鼠內(nèi)生肌酐清除率31-33
• 3.3 大鼠腎組織mTOR、raptor、rictor、Ezrin、α-SMA蛋白表達(dá)33-38
• 3.3.1 腎臟組織mTOR蛋白33-34
• 3.3.2 腎臟組織Raptor蛋白34-35
• 3.3.3 腎臟組織Rictor蛋白35-36
• 3.3.4 腎臟組織Ezrin蛋白36-37
• 3.3.5 腎臟組織α-SMA蛋白37-38
• 3.4 大鼠腎組織Ezrin-mRNA、α-SMA-mRNA的表達(dá)38-41
• 3.4.1 大鼠腎臟組織Ezrin-mRNA38-39
• 3.4.2 大鼠腎臟組織α-SMA-mRNA39-41
• 3.5 大鼠外周血CD~(4+)CD25~(high) Treg細(xì)胞百分比41-43
• 3.6 大鼠外周血TGF-β1、IL-17的表達(dá)43-45
• 3.6.1 大鼠外周血TGF-β143-44
• 3.6.2 大鼠外周血IL-1744-45
• 3.7 B組大鼠Raptor、Rictor、Ezrin、Ezrin-mRNA、α-SMA、α-SMA-mRNA、CD~(4+)CD25~(high) Treg、TGF-b1、IL-17的相關(guān)分析。45-52
• 3.7.1 B組大鼠Ezrin與Raptor、Rictor的相關(guān)分析45-46
• 3.7.2 B組大鼠Ezrin-mRNA與Raptor、Rictor的相關(guān)分析46
• 3.7.3 B組大鼠α-SMA與Raptor、Rictor的相關(guān)分析46-47
• 3.7.4 B組大鼠α-SMA-mRNA與Raptor、Rictor的相關(guān)分析47
• 3.7.5 B組大鼠CD~(4+)CD25~(high) Treg與Raptor、Rictor的相關(guān)分析47
• 3.7.6 B組大鼠TGF-β1 與Raptor、Rictor的相關(guān)分析47-48
• 3.7.7 B組大鼠IL-17與Raptor、Rictor的相關(guān)分析48
• 3.7.8 B組大鼠CD~(4+)CD25~(high) Treg與TGF-β1 相關(guān)分析48-49
• 3.7.9 B組大鼠CD~(4+)CD25~(high) Treg與Ezrin、Ezrin-mRNA相關(guān)分析· 3649
• 3.7.10 B組大鼠CD~(4+)CD25~(high) Treg與α-SMA、α-SMA-mRNA相關(guān)分析49
• 3.7.11 B組大鼠TGF-β1 與Ezrin、Ezrin-mRNA相關(guān)分析49-50
• 3.7.12 B組大鼠TGF-β1 與α-SMA、α-SMA-mRNA相關(guān)分析50
• 3.7.13 B組大鼠IL-17與Ezrin、Ezrin-mRNA相關(guān)分析50-51
• 3.7.14 B組大鼠IL-17與α-SMA、α-SMA-mRNA相關(guān)分析51-52
• 第4章 討論52-58
• 4.1 mTOR、Raptor、Raptor蛋白在DN中的表達(dá)及其臨床意義52-54
• 4.2 Ezrin、α-SMA蛋白在DN中的表達(dá)及其臨床意義54-55
• 4.3 Th17/Treg細(xì)胞在DN中的表達(dá)及其臨床意義55-58
• 第5章 結(jié)論與展望58-59
• 5.1 結(jié)論58
• 5.2 展望58-59
• 致謝59-60
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果64-65
• 綜述65-70
• 參考文獻(xiàn)69-70

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本文編號：1081536