本文關(guān)鍵詞：白藜蘆醇對(duì)低濃度過氧化氫促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖的凋亡誘導(dǎo)作用和可能機(jī)制

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【摘要】：背景類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)屬于免疫性疾病,其發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全明了,傳統(tǒng)的非甾體類抗炎藥等的治療,雖可以有效減緩病情,但不能從本質(zhì)上改變RA患者的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞,更不能徹底解決患者的病情發(fā)展問題。RA患者關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞過度增殖,對(duì)滑膜下軟骨的侵蝕可能是其致病重要的一個(gè)原因。從生理功能來看,關(guān)節(jié)滑膜可以產(chǎn)生滑液,起到潤(rùn)滑關(guān)節(jié)、供給關(guān)節(jié)營(yíng)養(yǎng)的作用,除此之外,關(guān)節(jié)滑膜還具有排除多余的滑液,排出脫落的軟骨碎屑等功能。然而,由于疾病原因所導(dǎo)致的滑膜組織異常增生,其異常組織則類似局限性侵襲生長(zhǎng)的腫瘤組織,會(huì)進(jìn)行性、持續(xù)性破壞關(guān)節(jié)骨性結(jié)構(gòu),繼而發(fā)生關(guān)節(jié)致畸,同時(shí)伴隨關(guān)節(jié)不同程度功能障礙。作為滑膜組織中的重要組分,成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)在關(guān)節(jié)破壞過程中,其作用舉足輕重,它可以分泌多種細(xì)胞因子、花生四烯酸代謝產(chǎn)物、炎性介質(zhì)等,參與整個(gè)破壞過程。大量研究文獻(xiàn)證實(shí)顯示,FLS的增殖在RA的發(fā)病和病程進(jìn)展中起到重要作用。RA患者的FLS失控性生長(zhǎng),具有異常增殖和侵蝕特性。研究表明,在RA關(guān)節(jié)滑膜的炎性病變中,活性氧(reactive oxygen species, ROS)參與了骨質(zhì)的損傷。研究證實(shí),Forkhead boxO (FoxOs)是具有種屬特異性的Forkhead轉(zhuǎn)錄因子亞家族,具有敏感的氧化還原反應(yīng)作用,參與控制和調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、活化和氧化過程,在調(diào)控機(jī)體代謝、細(xì)胞的增殖、氧化還原中起重要作用的基因,在細(xì)胞內(nèi)活性氧穩(wěn)態(tài)的維持過程中作用顯著,可增加細(xì)胞內(nèi)的抗氧化能力保護(hù)細(xì)胞免受氧化損害。既往研究顯示,Bcl-2是定位于線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的抗凋亡蛋白,Bax基因轉(zhuǎn)錄物廣泛存在于體內(nèi)各組織中,胞質(zhì)中的Bax蛋白從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位凋亡信號(hào)至線粒體膜上,激活caspase進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。非黃酮的多酚類化合物白藜蘆醇(resveratrol, RES)是研究較多的一類植物抗毒素,具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤作用等作用,對(duì)于相關(guān)代謝性疾病---RA的治療價(jià)值是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。目的 動(dòng)物模型采用弗氏完全佐劑,制備佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠,評(píng)價(jià)AA大鼠建模情況。通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn),觀察AA大鼠的氧化應(yīng)激情況,以及RES治療情況；體外培養(yǎng)滑膜細(xì)胞,探討研究RES對(duì)過氧化氫(H202)處理的大鼠AA-FLS凋亡的影響,分析各組FLS中FoxO1、FoxO4基因水平的表達(dá),并探討Fox基因在其凋亡過程中的作用。方法 90只SD大鼠,隨機(jī)分為正常組、模型組、白藜蘆醇(低劑量1 μmol/L、中劑量5μmol/L、高劑量20 μmol/L)給藥組、陽性藥組(NAC),每組15只。采用弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant, FCA),通過皮下給藥法,注射大鼠足趾部位,誘導(dǎo)SD大鼠建立AA大鼠動(dòng)物模型,14d成模后,連續(xù)給予SD大鼠采用灌胃法(intragastric administration, ig)白藜蘆醇12d,采用多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹度、體重等多方面綜合指標(biāo)的變化,進(jìn)行FCA誘導(dǎo)大鼠AA模型的原發(fā)、繼發(fā)情況評(píng)價(jià)。第26天,股動(dòng)脈放血處死大鼠,取血,分光光度計(jì)檢測(cè)各組大鼠機(jī)體的氧化應(yīng)激情況丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力。體外實(shí)驗(yàn),取致炎側(cè)踝關(guān)節(jié)滑膜組織,應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞,取培養(yǎng)第3代FLS用于實(shí)驗(yàn), (1)FLS分離鑒定：采用免疫細(xì)胞熒光染色,兔抗鼠VCAM-1多克隆抗體鑒定滑膜細(xì)胞； (2)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：采用CCK-8法觀察不同濃度的1-1202對(duì)FLS的增殖的影響；(3)細(xì)胞凋亡檢測(cè)：Annexin V-FITC-PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的RES對(duì)H2O2(20μmol/L)處理FLS的細(xì)胞凋亡率； (4)機(jī)制探討：采用RT-PCR檢測(cè)各組FLS中FoxO1、FoxO4基因水平的表達(dá),探討其誘導(dǎo)滑膜組織凋亡的內(nèi)在聯(lián)系；Western blot檢測(cè)分析FLS中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)變化情況,運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù),進(jìn)一步從細(xì)胞凋亡學(xué)角度闡明白藜蘆醇治療RA的作用機(jī)理。結(jié)果 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)AA大鼠經(jīng)FCA皮下注射法注射足趾部位,誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎14天后,AA大鼠足趾出現(xiàn)繼發(fā)性免疫炎癥反應(yīng),RES可有效減輕AA大鼠繼發(fā)性足腫脹、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)、體重下降。血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明模型組大鼠較正常組大鼠模型組SOD活力降低,MDA水平升高,與模型組比較,RES各治療組及NAC陽性對(duì)照組均能升高SOD水平,并降低MDA水平,以RES中、高劑量組具顯著意義(P0.05,P0.01)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CCK-8法觀察顯示,H2O2 (≤20μmol/L)在一定濃度范圍內(nèi),可以促進(jìn)FLS生長(zhǎng),而當(dāng)H2O2 (20μmol/L)時(shí),H202誘導(dǎo)的FLS凋亡數(shù)則會(huì)明顯增高,低劑量H2O2可促進(jìn)FLS增殖,白藜蘆醇可促進(jìn)低劑量H2O2誘導(dǎo)的FLS凋亡作用；Annexin V-FITC-PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在低濃度H2O2氧化應(yīng)激刺激下,FLS的細(xì)胞凋亡率會(huì)隨著RES濃度的升高,出現(xiàn)明顯的升高；采用RT-PCR檢測(cè)出,RES明顯降低FoxO1、FoxO4基因水平的表達(dá),FLS凋亡與某些FoxOs基因表達(dá)下調(diào)相關(guān),RES通過降低FLS內(nèi)FoxO1、FoxO4基因相對(duì)表達(dá)而實(shí)現(xiàn)凋亡誘導(dǎo)作用。Western blot檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),隨著RES濃度的升高,Bcl-2表達(dá)顯著降低,促凋亡蛋白Bax表達(dá)逐漸升高。結(jié)論 白藜蘆醇可有效改善AA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀,降低AA大鼠血清過氧化情況。機(jī)制研究表明,RES通過下調(diào)FoxO1、FoxO4基因、抗凋亡Bcl-2蛋白,抑制Bax蛋白表達(dá)誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞的凋亡。RES抑制AA大鼠FLS增生,促進(jìn)FLS凋亡,實(shí)現(xiàn)其治療目的；RES可通過調(diào)節(jié)凋亡蛋白Bcl-2/Bax相對(duì)表達(dá)誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡, 同時(shí),可通過調(diào)節(jié)凋亡蛋白實(shí)現(xiàn)促進(jìn)FLS凋亡的作用,降低Bcl-2蛋白表達(dá)、升高Bax表達(dá)可能是其促進(jìn)凋亡作用中的一個(gè)機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：白藜蘆醇 過氧化氫 滑膜細(xì)胞 凋亡 FoxO基因 Bc1-2/Bax蛋白
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R593.22
【目錄】：

• 英文縮略詞表6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-16
• 1 引言16-18
• 2 材料18-23
• 2.1 動(dòng)物18-19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器與設(shè)備19-20
• 2.3 試劑20-21
• 2.4 主要試劑配制21-23
• 3 實(shí)驗(yàn)方法23-32
• 3.1 RES對(duì)大鼠AA模型的影響23
• 3.2 RES對(duì)AA大鼠繼發(fā)性炎癥的影響23-26
• 3.3 AA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的采集、培養(yǎng)與鑒定26-27
• 3.4 RES體外給藥對(duì)AA大鼠免疫功能的影響27-32
• 4 結(jié)果32-43
• 4.1 RES對(duì)AA大鼠繼發(fā)性炎癥的影響32-36
• 4.2 RES對(duì)AA大鼠膝關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-38
• 4.3 H_2O_2對(duì)FLS增殖的影響38-39
• 4.4 RES增加H_2O_2誘導(dǎo)的FLS細(xì)胞凋亡39-40
• 4.5 RES下調(diào)低濃度H_2O_2誘導(dǎo)的FLS的Fox01、Fox04基因表達(dá)40-42
• 4.6 RES對(duì)H_2O_2誘導(dǎo)的FLS的凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)的影響42-43
• 5 討論43-46
• 6 結(jié)論46-48
• 參考文獻(xiàn)48-56
• 附錄 個(gè)人簡(jiǎn)歷56-57
• 致謝57-58
• 綜述58-68
• 參考文獻(xiàn)64-68

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本文編號(hào)：1040749