本文關(guān)鍵詞：iTRAQ聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)篩選慢性氟中毒大鼠骨組織差異蛋白及生物信息學(xué)分析

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【摘要】：目的:采用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),比較不同劑量氟中毒大鼠及對(duì)照組大鼠骨組織的蛋白表達(dá)差異,獲得氟中毒大鼠骨組織中差異表達(dá)蛋白。通過生物信息學(xué)分析鑒定這些差異表達(dá)蛋白,并分析蛋白相互作用及可能參與的信號(hào)通路,為揭示氟骨癥發(fā)生的分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。方法:1.慢性氟中毒大鼠模型的建立與驗(yàn)證:48只健康SD大鼠隨機(jī)分為4組,對(duì)照組飲用自來水,低氟組、中氟組、高氟組分別飲用含50、150、250 mg/L氟化鈉的自來水。飼養(yǎng)6個(gè)月后,檢測(cè)氟斑牙發(fā)生率,氟離子選擇電極法檢測(cè)各組大鼠尿氟、骨氟、牙氟、血清氟含量;取大鼠股骨干骺端進(jìn)行石蠟包埋切片,蘇木精-伊紅染色、光鏡觀察,骨組織形態(tài)學(xué)計(jì)量染氟大鼠骨組織形態(tài)學(xué)改變;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)大鼠血清骨代謝標(biāo)志物含量。2.采用iTRAQ聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)篩選差異蛋白:提取四組大鼠骨勻漿蛋白酶解為肽段,以iTRAQ試劑標(biāo)記,經(jīng)過強(qiáng)陽離子SCX交換,反相液相色譜分離,質(zhì)譜鑒定和蛋白檢索后得到差異蛋白;對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO分析、KEGG pathway分析、STRING分析等生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析,尋找差異蛋白顯著相關(guān)的生物學(xué)功能,參與的代謝通路和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,分析蛋白-蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò);篩選出關(guān)鍵蛋白MMP8(基質(zhì)金屬蛋白酶)、CRT(鈣網(wǎng)織蛋白)。3.免疫組織化學(xué)染色法驗(yàn)證MMP8、CRT的表達(dá):取大鼠骨組織石蠟切片,免疫組化超敏二步法染色觀察MMP8、CRT在股骨組織中的表達(dá),IPP軟件測(cè)定平均光密度驗(yàn)證蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1.慢性氟中毒大鼠模型建立及驗(yàn)證:(1)氟斑牙發(fā)生情況與氟負(fù)荷量的變化:各染氟組大鼠氟斑牙檢出率、尿氟、骨氟和血清氟含量均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而且隨染氟劑量增高,氟斑牙嚴(yán)重程度、尿氟、骨氟、牙氟和血氟呈上升趨勢(shì)。(2)大鼠股骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)結(jié)果:中、高氟組大鼠的骨皮質(zhì)厚度均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);低氟組骨小梁平均面積小于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);低中高氟組成骨細(xì)胞數(shù)均低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。BGP、BALP、PⅠNP檢測(cè)結(jié)果:低氟組與對(duì)照組比較呈下降趨勢(shì),BALP有顯著差異(P0.01),中、高氟組BGP、BALP含量小于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);CTX-Ⅰ、TRACP-5b檢測(cè)結(jié)果:低中、高氟組TRACP-5b含量均小于對(duì)照組,中、高氟組CTX-Ⅰ小于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.鑒定到顯著性差異蛋白質(zhì)63個(gè):(1)相對(duì)于正常組,低氟組差異蛋白共13個(gè),中氟組差異蛋白共35個(gè),高氟組差異蛋白共33個(gè);(2)差異蛋白參與的生物學(xué)過程有37種、細(xì)胞組分有39種、分子功能有40種;(3)參與的相關(guān)信號(hào)通路15條。(4)差異蛋白質(zhì)內(nèi)部構(gòu)建了基因網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖,51個(gè)蛋白質(zhì)的基因都有直接或間接的聯(lián)系。3.免疫組化驗(yàn)證MMP8與CRT表達(dá):(1)低氟組、中氟組、高氟組的骨細(xì)胞MMP-8的IOD值均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);低氟組成骨細(xì)胞MMP-8的IOD值高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)中氟組軟骨細(xì)胞CRT的IOD值低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);低氟組成骨細(xì)胞CRT的IOD值低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1成功構(gòu)建慢性氟中毒大鼠模型;骨組織形態(tài)計(jì)量及骨代謝標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果提示氟對(duì)成骨活性與破骨活性均有影響,且與染氟劑量有關(guān)。2、63個(gè)顯著差異蛋白、15條相關(guān)通路、51個(gè)互相作用蛋白可能直接或間接地參與了慢性氟中毒骨相損害分子機(jī)制。3.MMP8與CRT表達(dá)水平與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致,MMP-8和CRT的表達(dá)變化可能與氟性骨損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：iTRAQ 蛋白組學(xué) 氟中毒 差異蛋白 生物信息學(xué)
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R599.1
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-11
• 英文縮略詞表11-13
• 引言13-19
• 第一部分 慢性氟中毒大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⑴c驗(yàn)證19-39
• 材料與方法19-27
• 結(jié)果27-35
• 討論35-39
• 第二部分 基于iTRAQ結(jié)合 2D LC-MS/MS技術(shù)鑒定氟中毒大鼠骨組織的差異蛋白及生物信息學(xué)分析39-63
• 材料與方法39-49
• 結(jié)果49-58
• 討論58-63
• 第三部分 差異蛋白MMP-8 與CRT的驗(yàn)證63-71
• 材料與方法63-65
• 結(jié)果65-69
• 討論69-71
• 結(jié)論71-72
• 參考文獻(xiàn)72-79
• 附錄79-87
• 綜述87-96
• 參考文獻(xiàn)93-96
• 作者簡(jiǎn)歷96-97
• 致謝97-98
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集98

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3 張t，

本文編號(hào)：1032133