本文關(guān)鍵詞：功能化氧化石墨烯和缺陷介孔二氧化硅抑制Ⅱ型糖尿病中hIAPP聚集的研究

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【摘要】：Ⅱ型糖尿病(T2DM)是蛋白錯(cuò)誤折疊成β結(jié)構(gòu)淀粉樣蛋白沉淀的內(nèi)分泌疾病。大量的研究表明這種蛋白沉淀的主要成分是人類胰島淀粉樣蛋白(hIAPP)。h IAPP錯(cuò)誤折疊形成低聚物和成熟纖維的過程伴隨著細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡可能是由于氧化應(yīng)激,線粒體損傷或者細(xì)胞膜通透性的改變?cè)斐傻�。避免h IAPP形成有毒性的纖維是治療Ⅱ型糖尿病的一個(gè)合理方法。基于Ⅱ型糖尿病的發(fā)病機(jī)理,本論文設(shè)計(jì)合成了一種氧化石墨烯負(fù)載胰島素衍生物的納米復(fù)合物和另外一種缺陷發(fā)光介孔二氧化硅負(fù)載h IAPP部分片段甲基化的納米粒子,系統(tǒng)地研究了這兩類納米粒子在抑制h IAPP纖維化及其減少細(xì)胞毒性的作用,并深入探討了它們抑制h IAPP聚集的作用機(jī)制。本論文一共分為三章:第一章,簡單的介紹了Ⅱ型糖尿病,及其發(fā)病機(jī)理,hIAPP在發(fā)病過程的作用及hIAPP聚集機(jī)制的探討。接著綜述了各種藥物及納米材料在hIAPP聚集中的研究進(jìn)展,最后闡述了本課題的選題意義及目的。第二章,我們?cè)O(shè)計(jì)合成了用聚乙二醇(PEG)和胰島素衍生物(EALYLV)修飾的氧化石墨烯為藥物的納米復(fù)合物(nGO@PEG@E),納米氧化石墨烯(nGO)能夠吸附hIAPP單體,這樣可以減少溶液中游離的h IAPP濃度達(dá)到了抑制它聚集成纖維的目的。EALYLV是胰島素衍生物,它能夠特異性的結(jié)合hIAPP,能夠與hIAPP側(cè)鏈上的Arg11形成一個(gè)很強(qiáng)的鹽橋,它也能夠從Arg11跨越到hIAPP殘基上的Phe15阻斷分子形成纖維的主要作用區(qū)域,從而抑制它的聚集。納米復(fù)合物nGO@PEG@E不僅能夠抑制hIAPP的聚集還可以保護(hù)INS-1細(xì)胞不受h IAPP毒性的影響,穩(wěn)定線粒體膜電位,減少細(xì)胞內(nèi)的活性氧。第三章,h IAPP是一個(gè)37個(gè)氨基酸的多肽,片段8-20,20-29和30-37有能力形成纖維。NFGAIL作為一個(gè)短的hIAPP淀粉樣蛋白聚集的核,它有能力自組裝成β折疊結(jié)構(gòu)和有細(xì)胞毒性的纖維。NF(N-Me)GA(N-Me)IL能夠特異性的結(jié)合并且抑制h IAPP的聚集。缺陷介孔二氧化硅(DLMSNs)更加有利于細(xì)胞吸收的研究。本文我們合成了殼聚糖修飾并負(fù)載了N-Me)GA(N-Me)IL的DLMSNs(DL@CS@NF),它能夠抑制h IAPP的聚集,在TEM和AFM的實(shí)驗(yàn)中明顯的可以看到經(jīng)過DL@CS@NF處理后的h IAPP幾乎看不見成熟的纖維,在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中DL@CS@NF能夠減少hIAPP產(chǎn)生的細(xì)胞毒性和活性氧達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。總之,納米粒子DL@CS@NF可以作為Ⅱ型糖尿病治療的潛在藥物。
【關(guān)鍵詞】：Ⅱ型糖尿病 hIAPP 納米氧化石墨烯 缺陷介孔二氧化硅 胰島素衍生物
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 第一章 緒論11-33
• 1.1 糖尿病的介紹11
• 1.2 Ⅱ型糖尿病的發(fā)病機(jī)制11-12
• 1.3 h IAPP對(duì)Ⅱ型糖尿病的影響及其聚集機(jī)制12-14
• 1.4 影響h IAPP聚集的因素14-15
• 1.5 h IAPP可能的毒性機(jī)理15-17
• 1.6 抑制h IAPP等淀粉樣蛋白聚集的藥物17-21
• 1.6.1 小分子抑制劑17-18
• 1.6.2 以肽為基礎(chǔ)的淀粉樣蛋白抑制劑18-20
• 1.6.3 以抗體為基礎(chǔ)的抑制劑20-21
• 1.7 納米材料在抑制h IAPP聚集中的應(yīng)用21-25
• 1.7.1 無機(jī)納米粒子21-22
• 1.7.2 碳納米材料22-24
• 1.7.3 介孔納米材料24
• 1.7.4 磁性納米材料24-25
• 1.8 本課題的選題意義和研究目的25-27
• 參考文獻(xiàn)27-33
• 第二章 nGO@PEG@E納米復(fù)合物作為Ⅱ型糖尿病中抑制h IAPP聚集的研究33-57
• 2.1 摘要33
• 2.2 引言33-34
• 2.3 實(shí)驗(yàn)部分34-40
• 2.3.1 實(shí)驗(yàn)試劑及細(xì)胞培養(yǎng)34-35
• 2.3.2 溶液配制35
• 2.3.3 n GO@PEG@E納米復(fù)合物的制備35
• 2.3.4 n GO@PEG@E納米復(fù)合物的表征35-36
• 2.3.5 h IAPP聚集體的孵育36
• 2.3.6 檢測(cè)游離狀態(tài)的自由h IAPP36
• 2.3.7 h IAPP濁度檢測(cè)36
• 2.3.8 Th T熒光實(shí)驗(yàn)36-37
• 2.3.9 圓二色光譜（CD）實(shí)驗(yàn)37
• 2.3.10 透射電鏡（TFM）37
• 2.3.11 原子力顯微鏡（AFM）37
• 2.3.12 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）37-38
• 2.3.13 ANS熒光發(fā)射光譜檢測(cè)38
• 2.3.14 細(xì)胞毒性檢測(cè)38
• 2.3.15 乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)38-39
• 2.3.16 細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的檢測(cè)39
• 2.3.17 INS-1 細(xì)胞凋亡檢測(cè)39
• 2.3.18 線粒體膜電位的測(cè)定39
• 2.3.19 免疫熒光39-40
• 2.3.20 Caspase-3 活性測(cè)定40
• 2.3.21 統(tǒng)計(jì)方法40
• 2.4 結(jié)果和討論40-52
• 2.4.1 n GO，n GO@PEG和n GO@PEG@E的制備和表征40-41
• 2.4.2 游離h IAPP和濁度測(cè)定法41-42
• 2.4.3 Th T檢測(cè)和CD光譜檢測(cè)h IAPP結(jié)構(gòu)的改變42-43
• 2.4.4 TEM和AFM觀察h IAPP聚集形態(tài)的變化43-45
• 2.4.5 ANS檢測(cè)45-46
• 2.4.6 SDS-PAGE檢測(cè)46
• 2.4.7 一種快速檢測(cè)h IAPP聚集的方法[34, 35]46-48
• 2.4.8 MTT和LDH檢測(cè)48-49
• 2.4.9 納米復(fù)合物減少h IAPP多肽誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS49-50
• 2.4.10 納米復(fù)合物減低h IAPP細(xì)胞毒性保護(hù)INS-1 細(xì)胞50-51
• 2.4.11 納米復(fù)合物對(duì)h IAPP誘導(dǎo)線粒體膜電位的影響51
• 2.4.12 n GO@PEG@E降低caspase-3 的活性51-52
• 2.5 本章小結(jié)52-53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 第三章 DL@CS@NF納米粒子抑制h IAPP聚集及保護(hù)細(xì)胞免受h IAPP損傷的研究57-81
• 3.1 摘要57
• 3.2 引言57-59
• 3.3 實(shí)驗(yàn)部分59-64
• 3.3.1 實(shí)驗(yàn)試劑及細(xì)胞培養(yǎng)59
• 3.3.2 溶液配制59
• 3.3.3 h IAPP聚集體的制備59
• 3.3.4 MSNs，DLMSNs，DL@CS和DL@CS@NF的制備59-60
• 3.3.5 MSNs，DLMSNs，，DL@CS和DL@CS@NF的表征60
• 3.3.6 濁度實(shí)驗(yàn)檢測(cè)60-61
• 3.3.7 Th T熒光實(shí)驗(yàn)61
• 3.3.8 透射電子顯微鏡（TEM）61
• 3.3.9 原子力顯微鏡（AFM）61
• 3.3.10 納米粒子抑制熒光標(biāo)記的h IAPP聚集61
• 3.3.11 細(xì)胞毒性檢測(cè)61-62
• 3.3.12 細(xì)胞電導(dǎo)率的測(cè)定62
• 3.3.13 溶血實(shí)驗(yàn)62
• 3.3.14 Caspase-3 活性測(cè)定62
• 3.3.15 PARP裂解分析62-63
• 3.3.16 細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的檢測(cè)63
• 3.3.17 INS-1 細(xì)胞對(duì)DL@CS和DL@CS@NF納米粒子的吸收63
• 3.3.18 TUNEL-DAPI染色63-64
• 3.3.19 細(xì)胞線粒體膜電位（MMDP）的檢測(cè)64
• 3.3.20 統(tǒng)計(jì)方法64
• 3.4 結(jié)果和討論64-76
• 3.4.1 MSNs，DLMSNs，DL@CS和DL@CS@NF的制備和表征64-66
• 3.4.2 濁度和Th T檢測(cè)及納米粒子抑制熒光標(biāo)記的h IAPP聚集66-68
• 3.4.3 AFM和TEM觀察納米粒子對(duì)h IAPP形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響68-69
• 3.4.4 納米粒子毒性檢測(cè)69-71
• 3.4.5 細(xì)胞形態(tài)，Caspase-3 活性和PARP檢測(cè)71-72
• 3.4.6 活性氧（ROS）檢測(cè)72-73
• 3.4.7 細(xì)胞吸收實(shí)驗(yàn)73-74
• 3.4.8 TUNEL-DAPI共染色實(shí)驗(yàn)74-75
• 3.4.9 細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位檢測(cè)75-76
• 3.5 本章小結(jié)76-77
• 參考文獻(xiàn)77-81
• 碩士期間發(fā)表的論文81-82
• 致謝82

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