本文關(guān)鍵詞：SET蛋白調(diào)節(jié)精原細(xì)胞和精母細(xì)胞增殖和凋亡

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【摘要】：研究背景和目的：精子發(fā)生是一個(gè)精巧而復(fù)雜的過(guò)程,哺乳動(dòng)物的精子發(fā)生主要分為3個(gè)階段：精原細(xì)胞的自我更新和分化,精母細(xì)胞減數(shù)分裂以及精子形成。精子發(fā)生受多種因素的精細(xì)調(diào)節(jié)以確保把正確的基因和表觀遺傳信息傳給子代,包括激素、蛋白因子以及miRNAs的調(diào)節(jié)。在生精小管中生精細(xì)胞凋亡是生精細(xì)胞固有的特征,研究發(fā)現(xiàn)在小鼠的睪丸中有2次凋亡高峰期,即原始生殖細(xì)胞遷移到生殖腺嵴和開始第一波精子發(fā)生的時(shí)候。并且在正常的精子發(fā)生過(guò)程中一半以上的生精細(xì)胞發(fā)生凋亡。在正常精子發(fā)生中,生精細(xì)胞凋亡發(fā)揮著重要的作用,它能夠維持生精細(xì)胞的數(shù)量,去除有缺陷的生精細(xì)胞。但是異常的凋亡將影響精子發(fā)生,引起生育障礙。SET基因是原癌基因,可產(chǎn)生兩種蛋白：模板活化因子-1a (TAF-1a)和SET/TAF-1β,兩者氨基端的氨基酸不同,而SET/TAF-1β亞型發(fā)揮SET蛋白的主要生物學(xué)作用。SET蛋白的功能極為豐富,包括細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖凋亡、DNA修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄以及表觀遺傳等多個(gè)生物過(guò)程。研究還發(fā)現(xiàn)SET表達(dá)于卵巢卵泡膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞,參與卵巢雄激素的生成和卵母細(xì)胞的發(fā)育。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),SET蛋白主要表達(dá)于生精小管中的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞以及睪丸間質(zhì)細(xì)胞,在支持細(xì)胞中也有低表達(dá),提示SET蛋白調(diào)節(jié)精子發(fā)生以及睪丸間質(zhì)細(xì)胞雄激素的生成。綜上, SET蛋白作為睪丸內(nèi)局部表達(dá)的因子,可能參與調(diào)節(jié)精子發(fā)生。為驗(yàn)證上述假說(shuō),本研究以精原細(xì)胞株和精母細(xì)胞株為模型,干涉細(xì)胞中的SET蛋白表達(dá),研究SET蛋白對(duì)精原細(xì)胞和精母細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其作用機(jī)制。材料與方法：(1) 含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液在37℃、5%C02條件下培養(yǎng)小鼠精原細(xì)胞GC-1 spg和精母細(xì)胞GC-2spd。實(shí)驗(yàn)分2組：對(duì)照組轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列腺病毒(AdH1-siRNA/NS);實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染SET干涉腺病毒(AdH1-siRNA/SET).(2) 免疫熒光和共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)SET蛋白在GC-1 spg和GC-2 spd細(xì)胞中的表達(dá)與定位。(3) AdH1-siRNA/NS和AdH1-siRNA/SET感染GC-1 spg和GC-2 spd細(xì)胞48h,蛋白印跡(Western Blot)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后SET蛋白的表達(dá),驗(yàn)證SET干涉腺病毒的效率。(4) GC-1 spg和GC-2 spd細(xì)胞轉(zhuǎn)染AdH1-siRNA/NS和AdH1-siRNA/SET后48h,細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK8)檢測(cè)細(xì)胞活率。(5) 體外培養(yǎng)GC-1 spg和GC-2 spd細(xì)胞,轉(zhuǎn)染AdH1-siRNA/NS和AdH1-siRNA/SET后48h,5一溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。(6) GC-1 spg和GC-2 spd細(xì)胞轉(zhuǎn)染AdH1-siRNA/NS和AdH1-siRNA/SET后48h,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化；(7) GC-1 spg和GC-2 spd細(xì)胞轉(zhuǎn)染AdH1-siRNA/NS和AdH1-siRNA/SET后72h,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。(8) GC-1 spg和GC-2 spd細(xì)胞轉(zhuǎn)染AdH1-siRNA/NS和AdH1-siRNA/SET后48h和72h,提取細(xì)胞總蛋白,Western Blot檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡的相關(guān)因子AKT、p-AKT (T308)、p-AKT (S473)、caspase3、cleaved-caspase3、Bax、Bcl2、 caspase9、cleaved-caspase9、caspase8、cleaved-caspase8的變化。(9) 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS2統(tǒng)計(jì)學(xué)20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間差異,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：(1) SET蛋白表達(dá)于GC-1 spg和GC-2 spd細(xì)胞的胞核和胞漿中,且胞漿多于胞核。(2) GC-1 spg和GC-2 spd細(xì)胞轉(zhuǎn)染AdH1-siRNA/NS和AdH1-siRNA/SET后48h,在對(duì)照組相對(duì),GC-1 spg細(xì)胞和GC-2 spd細(xì)胞干涉組SET蛋白分別降低了55%(**P0.01)和50%(*P0.05),表明SET干涉腺病毒是有效的。(3) 降低SET蛋白表達(dá)后,與對(duì)照組相比,GC-1 spg和GC-2 spd細(xì)胞活率,分別減少了80%(**P0.01)%和50%(**P0.01)。(4) 降低SET蛋白表達(dá)后,與對(duì)照組相比,GC-1 spg和GC-2 spd細(xì)胞增殖分別減少了11%(*P0.05)和15%(**P0.01)。(5) 降低SET蛋白表達(dá)后,與對(duì)照組相比,GC-1 spgd的S期減少了7%(**P0.01),G2/M期增加了40%(**P0.01); GC-2 spd的S期減少了18%(*P0.05),G0/G1期增加了11%(**P0.01),G2/M期增加了65%(*P0.05)。(6) 降低SET蛋白表達(dá)后,與對(duì)照組相比,GC-1 spg和GC-2 spd細(xì)胞凋亡率分別增加了1.5倍(**P0.01)和5倍(**P0.01)。(7) 降低SET蛋白表達(dá)后,與對(duì)照組相比,GC-1 spg細(xì)胞和GC-2 spd細(xì)胞干涉組cleaved-caspase3分別增加了2.3倍(*P0.05)和1.6倍(*P0.05),Bcl2/Bax分別減少了60%(*P0.05)和50%(**P0.01),cleaved-caspase9分別增加了40%(*P0.05)和33%(**P0.01),cleaved-caspase8分別增加了2.2倍(*P0.05)和1-8倍(*P0.05), p-AKT (S473)/AKT分別減少了25%(*P0.05)和40%(**P0.01)。結(jié)論。(1) 降低小鼠精原細(xì)胞中的SET蛋白表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖。其機(jī)制是SET蛋白特異性抑制AKT (S473)磷酸化,下調(diào)AKT信號(hào)通路,激活內(nèi)源性和外源性凋亡信號(hào)通路。(2) 降低小鼠精母細(xì)胞中的SET蛋白表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖。其機(jī)制也是通過(guò)特異性抑制AKT (S473)磷酸化,下調(diào)AKT信號(hào)通路,激活內(nèi)源性和外源性凋亡信號(hào)通路。(3) 這些結(jié)果提示SET蛋白是調(diào)節(jié)精原細(xì)胞和精母細(xì)胞增殖和凋亡的重要因子,是調(diào)節(jié)精子發(fā)生的重要局部調(diào)節(jié)因子。(4) 本研究證明SET蛋白是調(diào)節(jié)生精細(xì)胞增殖和凋亡的重要局部調(diào)節(jié)因子,深入研究SET蛋白在精子發(fā)生中的作用有利于我們進(jìn)一步理解男性少弱畸精子癥的發(fā)生機(jī)制,對(duì)于臨床男性不育癥的治療具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：SET蛋白 精原細(xì)胞 精母細(xì)胞 細(xì)胞增殖 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R698.2
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-19
• 材料與方法19-29
• 結(jié)果29-41
• 討論41-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-53
• 文獻(xiàn)綜述53-76
• 參考文獻(xiàn)64-76
• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照76-78
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表文章情況78-79
• 致謝79

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 朱倩;崔毓桂;;精子發(fā)生的調(diào)節(jié)機(jī)制及其進(jìn)展[J];生殖醫(yī)學(xué)雜志;2016年04期

2 許波群;李瑛;薛凱;李梅;馬翔;刁飛揚(yáng);崔毓桂;劉嘉茵;;人SET基因小分子干擾RNA重組腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2010年02期

3 張才田;王雪松;胡雪玲;崔毓桂;童建孫;王興海;;雷公藤多甙抑制大鼠精子發(fā)生的研究[J];生殖醫(yī)學(xué)雜志;2008年02期

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本文編號(hào)：976828