發(fā)布時間：2017-10-03 02:25

  本文關(guān)鍵詞：酸性及堿性環(huán)境對慢性腎衰竭大鼠血管鈣化的影響

  更多相關(guān)文章： 慢性腎衰竭 血管鈣化 酸性環(huán)境 堿性環(huán)境 β-甘油磷酸 血管平滑肌細(xì)胞 鈣含量

【摘要】：目的:心血管疾病(Cardiovascular Disease,CVD)是慢性腎臟病(Chronic Kidney disease,CKD)患者死亡的主要病因,血管鈣化是CVD發(fā)生的重要危險因素。CKD患者的血管鈣化主要表現(xiàn)為血管中膜鈣化,其關(guān)鍵環(huán)節(jié)是血管平滑肌細(xì)胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)向成骨/成軟骨樣表型轉(zhuǎn)化。以往研究發(fā)現(xiàn),酸性及堿性環(huán)境可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能進(jìn)而影響骨形成。CKD患者的血管鈣化類似骨發(fā)育過程,因此我們推測,酸性及堿性環(huán)境是否可以通過影響VSMCs表型轉(zhuǎn)化來影響血管鈣化。為了探討酸性及堿性環(huán)境對血管鈣化的影響,本實驗以慢性腎衰竭大鼠血管鈣化和體外培養(yǎng)高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化為模型,觀察酸性及堿性環(huán)境對血管鈣化及Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)表達(dá)的影響。方法:1實驗動物體內(nèi)實驗:清潔級、健康、雄性、5周齡SD大鼠,于屏障環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。體外實驗:運(yùn)用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)SD大鼠胸主動脈VSMCs。2實驗分組體內(nèi)實驗:將33只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組,即對照組(6只)、慢性腎衰竭組(6只)、慢性腎衰竭血管鈣化組(7只)、酸干預(yù)組(7只)和堿干預(yù)組(7只)。用5/6腎切除術(shù)構(gòu)建大鼠慢性腎衰竭模型,骨化三醇灌胃誘導(dǎo)大鼠血管鈣化,飼飲NH4CL構(gòu)建大鼠慢性代謝性酸中毒模型,腹腔內(nèi)注射Na HCO3構(gòu)建大鼠慢性代謝性堿中毒模型。體外實驗:將VSMCs隨機(jī)分為4組,即正常對照組、p H7.4+高磷組、p H7.1+高磷組和p H7.7+高磷組。正常對照組采用低糖DMEM加10%胎牛血清的培養(yǎng)基,將p H值調(diào)整為7.4,作為正常培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);p H7.4+高磷組應(yīng)用高磷培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),即在正常培養(yǎng)基中加入10 mmol/L的β-甘油磷酸,并將p H值調(diào)整為7.4;p H7.1+高磷組在高磷培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上將p H值調(diào)整為7.1進(jìn)行培養(yǎng);p H7.7+高磷組則在高磷培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上將p H值調(diào)整為7.7進(jìn)行培養(yǎng)。3大鼠主動脈血各項指標(biāo)檢測:抽取大鼠主動脈血檢測血肌酐、尿素氮、p H值及HCO3-濃度,以判斷大鼠慢性腎衰竭模型、酸中毒模型、堿中毒模型是否構(gòu)建成功。4鈣化檢測:對大鼠胸主動脈血管采用von Kossa染色及鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法檢測鈣化情況。VSMCs的鈣化通過茜素紅染色及鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法來檢測。5堿性磷酸酶(ALP)活性測定:各組VSMCs通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞ALP活性。6 Runx2表達(dá)情況:對大鼠胸主動脈血管應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測Runx2的表達(dá)。VSMCs運(yùn)用RT-PCR和Western-blot方法檢測Runx2的表達(dá)。7統(tǒng)計學(xué)方法:實驗所取得的據(jù)數(shù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析,符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示,多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(ANOVA),組間兩兩比較用SNK檢驗(Student-Newman-Keuls)。P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1慢性腎衰竭大鼠模型的建立:與對照組比較,慢性腎衰竭組、慢性腎衰竭血管鈣化組、酸干預(yù)組和堿干預(yù)組大鼠血肌酐、尿素氮水平均明顯升高(P0.05);與慢性腎衰竭血管鈣化組比較,酸干預(yù)組大鼠動脈血p H值和HCO3-含量均降低(P0.05),堿干預(yù)組大鼠動脈血p H值和HCO3-含量均升高(P0.05)。2酸性及堿性環(huán)境對慢性腎衰竭大鼠胸主動脈血管鈣化的影響:von Kossa染色結(jié)果顯示,慢性腎衰竭血管鈣化組及堿干預(yù)組大鼠胸主動脈中膜可見大量棕黑色鈣鹽沉積,但對照組、慢性腎衰竭組和酸干預(yù)組大鼠胸主動脈均未發(fā)現(xiàn)棕黑色鈣鹽沉積;與慢性腎衰竭血管鈣化組比較,堿干預(yù)組大鼠胸主動脈中膜棕黑色鈣鹽沉積明顯增多。鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法檢測鈣含量結(jié)果顯示,與對照組比較,慢性腎衰竭血管鈣化組和堿干預(yù)組大鼠胸主動脈鈣含量明顯增高(P0.05);與慢性腎衰竭血管鈣化組比較,酸干預(yù)組大鼠胸主動脈鈣含量明顯降低(P0.05),堿干預(yù)組大鼠胸主動脈鈣含量明顯增高(P0.05)。3酸性及堿性環(huán)境對慢性腎衰竭大鼠胸主動脈血管Runx2表達(dá)的影響:免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,與對照組和慢性腎衰竭組比較,慢性腎衰竭血管鈣化組和堿干預(yù)組大鼠Runx2免疫組化評分(6.31±1.32vs2.08±0.83,6.31±1.32vs3.27±1.08,9.15±1.38vs2.08±0.83,9.15±1.38vs3.27±1.08)有所升高,其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與慢性腎衰竭血管鈣化組比較,酸干預(yù)組大鼠Runx2免疫組化評分(3.83±1.3vs6.31±1.32,P0.05)明顯降低,堿干預(yù)組大鼠Runx2免疫組化評分(9.15±1.38vs6.31±1.32,P0.05)明顯升高。4酸性及堿性環(huán)境對高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs鈣化的影響:茜素紅鈣化染色結(jié)果顯示,與正常對照組比較,p H7.4+高磷組及p H7.7+高磷組細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)增多;與p H7.4+高磷組比較,p H7.1+高磷組細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)減少,p H7.7+高磷組細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)明顯增多。鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法測定鈣含量結(jié)果顯示,與正常對照組比較,p H7.4+高磷組及p H7.7+高磷組細(xì)胞鈣含量增加(P0.05);與p H7.4+高磷組比較,p H7.1+高磷組細(xì)胞鈣含量減少,p H7.7+高磷組細(xì)胞鈣含量明顯增加,各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5酸性及堿性環(huán)境對高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs堿性磷酸酶(ALP)活性的影響:與正常對照組比較,p H7.4+高磷組及p H7.7+高磷組細(xì)胞ALP水平均有不同程度升高(P0.05);與p H7.4+高磷組比較,p H7.1+高磷組細(xì)胞ALP水平降低,p H7.7+高磷組細(xì)胞ALP水平明顯升高,各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。6酸性及堿性環(huán)境對高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs中Runx2表達(dá)的影響:RT-PCR法檢測各組細(xì)胞Runx2m RNA表達(dá)情況顯示,與正常對照組比較,p H7.4+高磷組及p H7.7+高磷組細(xì)胞Runx2m RNA表達(dá)均有不同程度的增加(P0.05);與p H7.4+高磷組比較,p H7.1+高磷組細(xì)胞Runx2m RNA表達(dá)減少,p H7.7+高磷組細(xì)胞Runx2m RNA表達(dá)明顯增加,各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Western-blot方法檢測各組細(xì)胞Runx2蛋白表達(dá)情況顯示,與正常對照組比較,p H7.4+高磷組及p H7.7+高磷組細(xì)胞Runx2蛋白表達(dá)均增加(P0.05);與p H7.4+高磷組比較,p H7.1+高磷組細(xì)胞Runx2蛋白表達(dá)減少,p H7.7+高磷組細(xì)胞Runx2蛋白表達(dá)明顯增加,各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:酸性環(huán)境可以抑制慢性腎衰竭大鼠血管鈣化的發(fā)生,堿性環(huán)境可以促進(jìn)慢性腎衰竭大鼠血管鈣化的發(fā)生,其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)Runx2的表達(dá),進(jìn)而影響了血管平滑肌細(xì)胞成骨/成軟骨樣表型轉(zhuǎn)化來實現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：慢性腎衰竭 血管鈣化 酸性環(huán)境 堿性環(huán)境 β-甘油磷酸 血管平滑肌細(xì)胞 鈣含量
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R692.5
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-16
• 材料與方法16-27
• 結(jié)果27-29
• 附圖29-31
• 附表31-32
• 討論32-35
• 結(jié)論35-36
• 參考文獻(xiàn)36-39
• 綜述 BMP-2 與慢性腎臟病患者血管鈣化關(guān)系的探討39-48
• 參考文獻(xiàn)44-48
• 致謝48-49
• 個人簡歷49

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本文編號：962640