發(fā)布時間：2017-10-02 19:06

  本文關(guān)鍵詞：Progranulin在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用

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【摘要】：研究目的高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia, hHcys)是導(dǎo)致終末期腎病(end stage renal disease, ESRD)的一個重要的危險因子和致病因素。近年來研究表明,hHcys能直接作用于腎小球,誘導(dǎo)腎小球功能紊亂,進一步導(dǎo)致腎小球硬化,最終發(fā)展為終末期腎病。腎小球內(nèi)皮細胞、基底膜和足細胞共同構(gòu)成了腎小球的濾過屏障,其中足細胞和腎小球內(nèi)皮細胞對維持腎臟功能和濾過屏障的選擇通透性都具有十分重要的作用。足細胞損傷可導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生,而腎小球內(nèi)皮細胞功能紊亂可介導(dǎo)炎癥應(yīng)答。但目前hHcys所致腎臟損傷特別是腎小球內(nèi)皮細胞與足細胞損傷的機制尚未完全明確。顆粒蛋白前體(progranulin, PGRN)是一種自分泌生長因子,由7.5個重復(fù)的同源性富含半胱氨酸顆粒蛋白區(qū)域組成。在上皮細胞、免疫細胞、神經(jīng)細胞及軟骨細胞等多種細胞中廣泛表達,與細胞增殖、腫瘤生長、胰島素抵抗、神經(jīng)退行性疾病、組織修復(fù)以及炎癥等多種病理生理學進程密切相關(guān)。前期我們課題組研究表明,在急性腎臟損傷中PGRN能夠通過抑制炎癥保護腎臟,但PGRN在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的慢性腎病中的作用,迄今未見報道。研究表明,Wnt/β-catenin信號通路與腎臟損傷有著密切的聯(lián)系,參與足細胞功能紊亂和蛋白尿形成等過程。為此,本實驗擬通過體內(nèi)和體外兩方面來研究PGRN 在 hHcys誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用及其調(diào)控機制與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。實驗方法與結(jié)果1.PGRN在高同型半胱氨酸誘導(dǎo)的腎臟損傷中的表達使用8周齡的C57BL/6J野生雄性小鼠隨機分為兩組,小鼠單腎摘除一周后,無葉酸飼料(folate free diet, FF diet)喂養(yǎng)10周構(gòu)建hHcys動物模型,正常飼料(normal diet, norm diet)作為對照。高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測無葉酸飲食血漿總同型半胱氨酸(total homocysteine, tHcys)含量升高,證明hHcys模型構(gòu)建成功。酶聯(lián)免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測尿白蛋白／肌酐比值升高；過碘酸-雪夫染色(periodic acid-schiff stain, PAS)方法對小鼠腎臟石蠟切片進行染色和透射電鏡(transmission electron microscope, TEM)的方法觀察腎臟足細胞損傷,hHcys模型腎臟中出現(xiàn)系膜基質(zhì)增生,基底膜厚度不均,足突融合,提示腎臟功能障礙,腎小球出現(xiàn)損傷。ELISA檢測血漿中PGRN水平,發(fā)現(xiàn)血漿中PGRN降低。通過蛋白免疫印跡(western blot, WB)免疫組織化學染色(immunohistochemistry, IHC)、免疫熒光(immunofluorescence, IF)雙染驗證PGRN在腎臟中表達變化和分布,在腎小球內(nèi)皮細胞、足細胞和近曲小管中均有表達,在腎小球中PGRN表達降低。體外實驗,使用L-型同型半胱氨酸(L-homocysteine, L-Hcys)刺激腎臟四種固有細胞腎小球內(nèi)皮細胞(glomerular endothelial cell, GEnC) 、腎小球足細胞(human podocyte, HPC)、系膜細胞(rat mesangial cell, RMC)及腎小管上皮細胞(human kidney 2, HK-2),結(jié)果顯示PGRN在GEnC 和 HPC中呈現(xiàn)L-Hcys劑量依賴性降低。2. PGRN在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用C57BL/6J野生雄性小鼠和Grn基因敲除小鼠(B6(Cg)-Grntm1.1Aidi/J)雄性小鼠隨機分為四組,構(gòu)建hHcys動物模型。檢測血漿tHcys,尿白蛋白／肌酐比值,并進行PAS染色和透射電鏡分析,結(jié)果顯示,PGRN缺失不影響無葉酸飲食誘導(dǎo)的血漿Hcys水平的變化,但加重高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷。實時定量RT-PCR檢測腎臟中炎癥因子的表達、IHC檢測中性粒細胞的標記物Ly6B和巨噬細胞的標記物CD68,結(jié)果顯示P GRN的缺失加重hHcys導(dǎo)致的炎癥應(yīng)答及炎性細胞浸潤。WB、 IF結(jié)果顯示,Grn基因敲除加重了hHcys介導(dǎo)的腎臟組織中足細胞裂孔隔膜蛋白nephrin、 podocin形態(tài)損傷,以及緊密連接蛋白occludin蛋白表達降低。體外實驗,WB.IF結(jié)果顯示,外源重組PGRN (recombinant PGRN, rPGRN)能逆轉(zhuǎn)Hcys誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細胞間緊密連接蛋白閉合小環(huán)蛋白1(zonula occludens-1, ZO-1)蛋白水平降低及形態(tài)的損傷。3.PGRN在保護高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用機制高同型半胱氨酸血癥野生型及Grn基因敲除小鼠腎臟中的β-catenin的明顯活化。體外實驗中,L-Hcys能夠誘導(dǎo)GEnC和HPC中P-catenin的活化,而加入外源rPGRN則能抑制這一作用,說明PGRN可能通過抑制Wnt/p-catenin信號通路來保護hHcy誘導(dǎo)的腎臟損傷。結(jié)論與創(chuàng)新性本研究首次發(fā)現(xiàn),PGRN 在 hHcys模型腎臟中顯著降低,并且在GEnC和HPC 中， PGRN呈現(xiàn)出Hcys劑量依賴性降低。PGRN缺失加重hHcys介導(dǎo)的腎小球損傷、炎癥應(yīng)答、炎癥細胞浸潤、裂孔隔膜蛋白和緊密連接蛋白破壞,從而損傷腎小球濾過屏障及腎臟功能。PGRN的保護作用可能依賴于對V Vnt/β-catenin信號通路的抑制。本研究有助于進一步闡明高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)腎損傷的病理生理學機制,為PGRN作為靶點治療腎小球疾病提供一定的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：高同型半胱氨酸血癥 顆粒蛋白前體 Wnt/β-catenin 腎臟
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R692
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-17
• 符號說明17-20
• 實驗材料20-28
• 一、實驗動物20
• 二、藥品與試劑20-22
• 三、藥品及試劑配制方法22-26
• 四、實驗器材26-28
• 實驗方法28-41
• 第一部分：PGRN在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷中的表達28-35
• 第二部分：PGRN在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用35-39
• 第三部分：PGRN在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用機制39-41
• 實驗結(jié)果41-57
• 第一部分：PGRN在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷中的表達41-48
• 第二部分：PGRN在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用48-55
• 第三部分：PGRN在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用機制55-57
• 討論57-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻62-66
• 致謝66-67
• 攻讀碩士學位期間參與發(fā)表的論文、著作67-68
• 學位論文評閱及答辯情況表68

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本文編號：961298