本文關(guān)鍵詞：Progranulin在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用

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【摘要】：研究目的高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia, hHcys)是導(dǎo)致終末期腎病(end stage renal disease, ESRD)的一個(gè)重要的危險(xiǎn)因子和致病因素。近年來(lái)研究表明,hHcys能直接作用于腎小球,誘導(dǎo)腎小球功能紊亂,進(jìn)一步導(dǎo)致腎小球硬化,最終發(fā)展為終末期腎病。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜和足細(xì)胞共同構(gòu)成了腎小球的濾過(guò)屏障,其中足細(xì)胞和腎小球內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)維持腎臟功能和濾過(guò)屏障的選擇通透性都具有十分重要的作用。足細(xì)胞損傷可導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生,而腎小球內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂可介導(dǎo)炎癥應(yīng)答。但目前hHcys所致腎臟損傷特別是腎小球內(nèi)皮細(xì)胞與足細(xì)胞損傷的機(jī)制尚未完全明確。顆粒蛋白前體(progranulin, PGRN)是一種自分泌生長(zhǎng)因子,由7.5個(gè)重復(fù)的同源性富含半胱氨酸顆粒蛋白區(qū)域組成。在上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞中廣泛表達(dá),與細(xì)胞增殖、腫瘤生長(zhǎng)、胰島素抵抗、神經(jīng)退行性疾病、組織修復(fù)以及炎癥等多種病理生理學(xué)進(jìn)程密切相關(guān)。前期我們課題組研究表明,在急性腎臟損傷中PGRN能夠通過(guò)抑制炎癥保護(hù)腎臟,但PGRN在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的慢性腎病中的作用,迄今未見(jiàn)報(bào)道。研究表明,Wnt/β-catenin信號(hào)通路與腎臟損傷有著密切的聯(lián)系,參與足細(xì)胞功能紊亂和蛋白尿形成等過(guò)程。為此,本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)體內(nèi)和體外兩方面來(lái)研究PGRN 在 hHcys誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用及其調(diào)控機(jī)制與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果1.PGRN在高同型半胱氨酸誘導(dǎo)的腎臟損傷中的表達(dá)使用8周齡的C57BL/6J野生雄性小鼠隨機(jī)分為兩組,小鼠單腎摘除一周后,無(wú)葉酸飼料(folate free diet, FF diet)喂養(yǎng)10周構(gòu)建hHcys動(dòng)物模型,正常飼料(normal diet, norm diet)作為對(duì)照。高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測(cè)無(wú)葉酸飲食血漿總同型半胱氨酸(total homocysteine, tHcys)含量升高,證明hHcys模型構(gòu)建成功。酶聯(lián)免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)尿白蛋白／肌酐比值升高；過(guò)碘酸-雪夫染色(periodic acid-schiff stain, PAS)方法對(duì)小鼠腎臟石蠟切片進(jìn)行染色和透射電鏡(transmission electron microscope, TEM)的方法觀察腎臟足細(xì)胞損傷,hHcys模型腎臟中出現(xiàn)系膜基質(zhì)增生,基底膜厚度不均,足突融合,提示腎臟功能障礙,腎小球出現(xiàn)損傷。ELISA檢測(cè)血漿中PGRN水平,發(fā)現(xiàn)血漿中PGRN降低。通過(guò)蛋白免疫印跡(western blot, WB)免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemistry, IHC)、免疫熒光(immunofluorescence, IF)雙染驗(yàn)證PGRN在腎臟中表達(dá)變化和分布,在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞和近曲小管中均有表達(dá),在腎小球中PGRN表達(dá)降低。體外實(shí)驗(yàn),使用L-型同型半胱氨酸(L-homocysteine, L-Hcys)刺激腎臟四種固有細(xì)胞腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(glomerular endothelial cell, GEnC) 、腎小球足細(xì)胞(human podocyte, HPC)、系膜細(xì)胞(rat mesangial cell, RMC)及腎小管上皮細(xì)胞(human kidney 2, HK-2),結(jié)果顯示PGRN在GEnC 和 HPC中呈現(xiàn)L-Hcys劑量依賴性降低。2. PGRN在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用C57BL/6J野生雄性小鼠和Grn基因敲除小鼠(B6(Cg)-Grntm1.1Aidi/J)雄性小鼠隨機(jī)分為四組,構(gòu)建hHcys動(dòng)物模型。檢測(cè)血漿tHcys,尿白蛋白／肌酐比值,并進(jìn)行PAS染色和透射電鏡分析,結(jié)果顯示,PGRN缺失不影響無(wú)葉酸飲食誘導(dǎo)的血漿Hcys水平的變化,但加重高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷。實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)腎臟中炎癥因子的表達(dá)、IHC檢測(cè)中性粒細(xì)胞的標(biāo)記物L(fēng)y6B和巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物CD68,結(jié)果顯示P GRN的缺失加重hHcys導(dǎo)致的炎癥應(yīng)答及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。WB、 IF結(jié)果顯示,Grn基因敲除加重了hHcys介導(dǎo)的腎臟組織中足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白nephrin、 podocin形態(tài)損傷,以及緊密連接蛋白o(hù)ccludin蛋白表達(dá)降低。體外實(shí)驗(yàn),WB.IF結(jié)果顯示,外源重組PGRN (recombinant PGRN, rPGRN)能逆轉(zhuǎn)Hcys誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白閉合小環(huán)蛋白1(zonula occludens-1, ZO-1)蛋白水平降低及形態(tài)的損傷。3.PGRN在保護(hù)高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用機(jī)制高同型半胱氨酸血癥野生型及Grn基因敲除小鼠腎臟中的β-catenin的明顯活化。體外實(shí)驗(yàn)中,L-Hcys能夠誘導(dǎo)GEnC和HPC中P-catenin的活化,而加入外源rPGRN則能抑制這一作用,說(shuō)明PGRN可能通過(guò)抑制Wnt/p-catenin信號(hào)通路來(lái)保護(hù)hHcy誘導(dǎo)的腎臟損傷。結(jié)論與創(chuàng)新性本研究首次發(fā)現(xiàn),PGRN 在 hHcys模型腎臟中顯著降低,并且在GEnC和HPC 中， PGRN呈現(xiàn)出Hcys劑量依賴性降低。PGRN缺失加重hHcys介導(dǎo)的腎小球損傷、炎癥應(yīng)答、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、裂孔隔膜蛋白和緊密連接蛋白破壞,從而損傷腎小球?yàn)V過(guò)屏障及腎臟功能。PGRN的保護(hù)作用可能依賴于對(duì)V Vnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制。本研究有助于進(jìn)一步闡明高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)腎損傷的病理生理學(xué)機(jī)制,為PGRN作為靶點(diǎn)治療腎小球疾病提供一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：高同型半胱氨酸血癥 顆粒蛋白前體 Wnt/β-catenin 腎臟
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R692
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-17
• 符號(hào)說(shuō)明17-20
• 實(shí)驗(yàn)材料20-28
• 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物20
• 二、藥品與試劑20-22
• 三、藥品及試劑配制方法22-26
• 四、實(shí)驗(yàn)器材26-28
• 實(shí)驗(yàn)方法28-41
• 第一部分：PGRN在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷中的表達(dá)28-35
• 第二部分：PGRN在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用35-39
• 第三部分：PGRN在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用機(jī)制39-41
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-57
• 第一部分：PGRN在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷中的表達(dá)41-48
• 第二部分：PGRN在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用48-55
• 第三部分：PGRN在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用機(jī)制55-57
• 討論57-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-66
• 致謝66-67
• 攻讀碩士學(xué)位期間參與發(fā)表的論文、著作67-68
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表68

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