發(fā)布時(shí)間：2017-09-29 16:16

  本文關(guān)鍵詞：自噬參與胰島素抵抗介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷

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【摘要】：目的：在全世界范圍內(nèi),糖尿病腎病(Diabetic nephropathy, DN)已經(jīng)成為引起終末期腎臟病的一個(gè)首要原因。糖尿病腎病是糖尿病的一個(gè)嚴(yán)重并發(fā)癥,大約超過(guò)40%的2型糖尿病患者會(huì)出現(xiàn)這一并發(fā)癥。以往的研究表明,胰島素抵抗是糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病原因和病程進(jìn)展中的一個(gè)關(guān)鍵性因素。在糖尿病腎病領(lǐng)域,腎臟足細(xì)胞是腎小球當(dāng)中的胰島素信號(hào)反應(yīng)細(xì)胞,失去胰島素敏感性的腎臟足細(xì)胞即使在正常的血糖條件下也會(huì)出現(xiàn)蛋白尿的表現(xiàn),這說(shuō)明足細(xì)胞中的胰島素信號(hào)對(duì)于正常腎小球的功能是必不可少的。自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種分解代謝過(guò)程,它通過(guò)聚集和降解功能障礙的細(xì)胞器來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。自噬障礙與很多人類(lèi)疾病密切相關(guān),越來(lái)越多的證據(jù)表明調(diào)節(jié)白噬將會(huì)成為治療糖尿病的一個(gè)新靶點(diǎn)。目前關(guān)于在胰島素抵抗的足細(xì)胞中自噬過(guò)程是否發(fā)生改變?nèi)耘f是一個(gè)開(kāi)放性的問(wèn)題,而且關(guān)于自噬是否參與胰島素抵抗介導(dǎo)的腎臟足細(xì)胞損傷也不明確。本研究旨在探討：自噬在糖尿病腎病中的作用,并且主要著眼于自噬在發(fā)生胰島素抵抗的腎臟足細(xì)胞中的作用。方法：1. 用shRNA慢病毒感染腎臟足細(xì)胞,改變胰島素受體的表達(dá),分別使用RT-qPCR及蛋白質(zhì)免疫印記(Wesrern Blot)方法來(lái)驗(yàn)證敲除效率。2.敲除胰島素受體后檢測(cè)足細(xì)胞自噬水平：(1)蛋白質(zhì)免疫印記(western blot)檢測(cè)腎臟足細(xì)胞自噬水平的變化。200uM胰島素分別刺激正常組,對(duì)照組,胰島素受體敲除組,用Western Blot檢測(cè)p62,Beclin;50um氯喹分別刺激或不刺激對(duì)照組,胰島素受體敲除組,用Western Blot檢測(cè)LC3的變化。(2)免疫熒光檢測(cè)腎臟足細(xì)胞自噬水平的變化。200uM胰島素分別刺激對(duì)照組,胰 島素受體敲除組,用免疫熒光檢測(cè)p62, Beclin及LC3的表達(dá)。(3)透射電鏡檢測(cè)腎臟足細(xì)胞自噬小體數(shù)量的變化。200uM胰島素分別刺激對(duì)照組和胰島素受體敲除組,利用電鏡檢測(cè)自噬小體的數(shù)量。3.敲除胰島素受體后檢測(cè)足細(xì)胞功能蛋白nephrin的變化：胰島素刺激腎臟足細(xì)胞,檢測(cè)nephrin蛋白的變化。200uM胰島素分別刺激正常組,對(duì)照組,胰島素受體敲除組,用western blot和免疫熒光檢測(cè)nephrin蛋白的變化。4.應(yīng)用雷帕霉素激活自噬后檢測(cè)足細(xì)胞自噬水平和nephrin蛋白表達(dá)的變化。l0uM雷帕霉素刺激胰島素受體敲除組,利用western blot檢測(cè)p62和nephrin;50uM氯喹分別刺激或不刺激雷帕霉素處理組,利用western blot檢測(cè)LC3。結(jié)果：1. 使用shRNA'慢病毒感染腎臟足細(xì)胞可以減少胰島素受體的表達(dá)。(P0.05)2. 敲除胰島素受體后自噬水平降低。(1)免疫印記表明敲除胰島素受體的腎臟足細(xì)胞與對(duì)照組腎臟足細(xì)胞相比p62表達(dá)水平明顯升高,而LC3和Beclinl的表達(dá)水平明顯降低。(P0.05)(2)免疫熒光顯示敲除胰島素受體的腎臟足細(xì)胞與對(duì)照組腎臟足細(xì)胞相比p62表達(dá)水平升高,而LC3和Beclinl的表達(dá)降低。(3)透射電鏡顯示敲除胰島素受體的腎臟足細(xì)胞與對(duì)照組腎臟足細(xì)胞相比自噬小體的數(shù)量明顯減少。3. 免疫印記和免疫熒光都表明敲除胰島素受體的腎臟足細(xì)胞與對(duì)照組腎臟足細(xì)胞相比nephrin的表達(dá)降低。4. 雷帕霉素刺激敲除胰島素受體的腎臟足細(xì)胞與未加入雷帕霉素的敲除胰島素受體的腎臟足細(xì)胞相比,自噬水平和nephrin的表達(dá)明顯升高。(P0.05)結(jié)論：我們的結(jié)果表明當(dāng)腎臟足細(xì)胞失去胰島素敏感性時(shí)自噬水平會(huì)被抑制,并且會(huì)造成腎臟足細(xì)胞損傷;雷帕霉素作為mTOR抑制劑,可通過(guò)激活自噬改善胰島素抵抗引起的腎臟足細(xì)胞損傷。
【關(guān)鍵詞】：腎臟足細(xì)胞 胰島素抵抗 自噬 糖尿病腎病
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R587.2;R692.9
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 符號(hào)說(shuō)明11-13
• 前言13-16
• 材料與方法16-30
• 結(jié)果30-32
• 討論32-34
• 結(jié)論34-35
• 附圖35-41
• 參考文獻(xiàn)41-46
• 致謝46-47
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文47-48
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表48

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本文編號(hào)：943003