本文關(guān)鍵詞：腦腸肽對腎間質(zhì)纖維化療效及作用機(jī)制的研究

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【摘要】：第一章腦腸肽對UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化影響及機(jī)制研究背景：腎間質(zhì)纖維化(Renal interstitial fibrosis, RIF)是由多種原因引起的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)過渡沉積,并最終導(dǎo)致腎臟纖維形成和功能喪失,是多種慢性腎臟疾病(Chronic kidney disease, CKD)進(jìn)展至終末期腎病的最后共同通路,也是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的主要病理基礎(chǔ)。目前針對終末期腎衰竭只能實施腹膜透析、血液透析和腎臟移植等替代療法,而透析治療的并發(fā)癥多、患者的生活質(zhì)量不高；腎臟移植又存在供體短缺及腎移植術(shù)后相關(guān)并發(fā)癥等問題,因此及早干預(yù)甚至逆轉(zhuǎn)腎臟纖維化對于防治終末期腎衰竭具有重要意義。腦腸肽是由28個氨基酸殘基組成的胃腸激素,主要由胃底黏膜的泌酸腺X/A樣細(xì)胞合成并分泌。腦腸肽作為促生長激素釋放激素內(nèi)源性配體,能明顯促進(jìn)生長激素的分泌,并具有調(diào)控能量代謝及胃腸功能的作用。近年來大量的研究表明腦腸肽還具有減輕炎癥反應(yīng)和抗纖維化的作用。腦腸肽在多種類型的動物纖維化模型和體外實驗中均能發(fā)揮較強的抗纖維化作用。在腎臟缺血再灌注模型中,腦腸肽能減輕炎癥反應(yīng),減少細(xì)胞凋亡,改善腎臟功能,但腦腸肽在腎臟纖維化模型中的作用機(jī)制尚不明確。目的：觀察腦腸肽對單側(cè)輸尿管結(jié)扎(Unilateral ureteral obstruction, UUO)大鼠腎間質(zhì)纖維化動物模型RIF及相關(guān)纖維化因子表達(dá)的影響；進(jìn)而探討腦腸肽抗腎臟纖維化的作用機(jī)制。實驗方法：1、實驗分組及模型制作將雄性SD大鼠(40只)隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(Sham+Vehicle),假手術(shù)組+腦腸肽治療組(Sham+Ghrelin),模型組(UUO+Vehicle),腦腸肽治療組(UUO+Ghrelin)。模型組及腦腸肽治療組行左側(cè)輸尿管結(jié)扎制成大鼠UUO模型。而假手術(shù)組大鼠僅分離左側(cè)輸尿管,不進(jìn)行結(jié)扎,麻醉及其余手術(shù)步驟與模型組相同。術(shù)后14天處死大鼠,收集腎臟標(biāo)本進(jìn)行相應(yīng)實驗指標(biāo)檢測。2、Masson染色按常規(guī)方法行Masson染色。取Masson染色切片,每例切片高倍鏡下(x200)觀察10個互不重疊腎小管間質(zhì)視野,熒光顯微鏡下觀察、拍照、分析。3、腎臟組織石蠟切片制作大鼠麻醉后,分別用生理鹽水和4%多聚甲醛溶液經(jīng)心臟灌注。梗阻側(cè)腎臟組織,于4%多聚甲醛溶液中浸泡24小時后,按照常規(guī)石蠟包埋法制成石蠟標(biāo)本并切片,切片厚度為3μm,撈片、風(fēng)干后備用。4、免疫組化組織切片經(jīng)脫蠟、水化,在檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L)中給予微波熱修復(fù)30min。適度冷卻后依次給予0.3%過氧化氫溶液、山羊血清、一抗、生物素化二抗和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液封閉和孵育。DAB顯色液顯色,中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察并拍照。5、免疫熒光石蠟切片脫蠟至水,在Tris-EDTA (PH8.5)或檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L)中給予微波熱修復(fù),血清封閉后滴加一抗,4℃孵育12-24h,PBS溶液洗滌后滴加相應(yīng)熒光二抗,37℃孵育1h。熒光顯微鏡下觀察、拍照、分析。6、Western Blot方法檢測蛋白表達(dá)變化大鼠麻醉后處死,取梗阻側(cè)腎臟組織約1OOmg,液氮中保存?zhèn)溆�。組織標(biāo)本經(jīng)勻漿、裂解、離心(12000rpm,5℃,10min)后,蛋白濃度檢測試劑盒測定總蛋白濃度。蛋白裂解液依次經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗及二抗孵育、顯影及定影。凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析α-SMA、E-cadherin、FN、col-Ⅰ、col-Ⅲ、TGF-β1、 p-Smad3蛋白表達(dá)變化。7、統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,組間比較采用ONE-WAY方差分析,多重比較用LSD-t檢驗,以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：(1) Masson染色結(jié)果顯示UUO術(shù)后14天模型組大鼠梗阻側(cè)腎組織見明顯間質(zhì)纖維化病理改變；與模型組相比,腦腸肽治療組RIF面積明顯減少。免疫組化結(jié)果顯示UUO術(shù)后14天模型組大鼠梗阻側(cè)腎臟可見大量FN, col-Ⅰ蛋白表達(dá)；而腦腸肽治療組大鼠梗阻側(cè)腎臟FN, col-Ⅰ, col-Ⅲ蛋白明顯下降。(2)WB結(jié)果顯示UUO術(shù)后14天模型組大鼠梗阻側(cè)腎臟TGF-β1, p-Smad3表達(dá)明顯增多；腦腸肽干預(yù)組TGF-β1, p-Smad3表達(dá)則較前明顯下降。TGF-β1免疫組化染色結(jié)果與WB結(jié)果相似。(3)免疫組化結(jié)果顯示UUO術(shù)后14天模型組大鼠梗阻側(cè)腎臟α-SMA, E-cadherin, FN的表達(dá)增多,E-cadherin的表達(dá)減少；腦腸肽干預(yù)后α-SMA, FN的表達(dá)明顯下降,E-cadherin無明顯下降。WB的結(jié)果同樣證實腦腸肽治療組大鼠梗阻側(cè)腎臟α-SMA, FN的表達(dá)下降,而E-cadherin的表達(dá)無明顯下降。結(jié)論：(1)腦腸肽具有抗腎間質(zhì)纖維化作用。(2)腦腸肽能通過阻斷TGF-β1/Smad3信號通路,從而抑制腎間質(zhì)纖維化。(3)腦腸肽能夠通過抑制腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial mesenchymal transition, EMT)過程,從而抑制腎間質(zhì)纖維化。第二章腦腸肽對纖維化炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制研究背景：炎癥反應(yīng)是RIF的始動環(huán)節(jié)之一,在纖維化過程中具有非常重要的作用。炎癥細(xì)胞侵潤是早期腎臟損傷的重要病理表現(xiàn),炎癥反應(yīng)的遷延和持續(xù),最終促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的形成和腎臟失功。炎癥細(xì)胞侵潤在腎臟纖維化過程中發(fā)揮著重要作用,而趨化因子和炎癥因子的釋放是炎癥細(xì)胞侵潤和炎癥反應(yīng)持續(xù)的關(guān)鍵因素。大量研究表明腦腸肽能夠通過抑制炎癥細(xì)胞侵潤、炎性因子的釋放以及實質(zhì)細(xì)胞凋亡,在炎癥性腸病、急性胰腺炎、膿毒血癥、內(nèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎等急慢性炎癥反應(yīng)性疾病中發(fā)揮重要的抗炎及治療作用。在大鼠腎臟缺血再灌注模型中,腦腸肽能減輕受損腎臟炎癥反應(yīng),減少細(xì)胞凋亡,改善腎臟功能。目的：觀察腦腸肽對UUO大鼠腎組織炎癥細(xì)胞侵潤,炎癥因子、趨化因子表達(dá)和對腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響；探討腦腸肽抗腎臟炎癥及腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。方法：1、實驗分組及模型制作將雄性SD大鼠(40只)隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(Sham+Vehicle),假手術(shù)組+腦腸肽治療組(Sham+Ghrelin),模型組(UUO+Vehicle),腦腸肽治療組(UUO+Ghrelin)。模型組及腦腸肽治療組行左側(cè)輸尿管結(jié)扎制成大鼠UUO模型。而假手術(shù)組大鼠僅分離左側(cè)輸尿管,不進(jìn)行結(jié)扎,麻醉及其余手術(shù)步驟與模型組相同。術(shù)后7天處死大鼠,收集腎臟標(biāo)本進(jìn)行相應(yīng)實驗指標(biāo)檢測。2、腎臟組織石蠟切片制作(實驗方法同前)3、免疫組化(實驗方法同前)4、Western Blot方法檢測蛋白表達(dá)變化(實驗方法同前)5、TUNEL染色應(yīng)用TUNEL方法,按照In Situ Cell Death Detection Kit (Roche)的步奏進(jìn)行,蘇木精復(fù)染核,梯度乙醇脫水,中性樹膠封片。每張切片高倍鏡下(x 400)依次觀察腎間質(zhì)區(qū)域20個不重疊視野,計數(shù)TUNEL陽性的細(xì)胞數(shù)。6、Real-time PCRRT-PCR Trizol法提取組織RNA,并進(jìn)行質(zhì)檢,質(zhì)檢合格后逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA,并通過Prime5.0進(jìn)行引物序列設(shè)計。IL-1p上游引物：5'-CCT CTG ACA GGC AAC CAC TTA-3'; MCP-1上游引物:5'-GTG TCC CAA AGA AGC TGT AGTATT-3',下游引物：5'-GTG CTG AAG TCC TTA GGG TGA-31; TNF-α上游引物：5'-GTC GTA GCA AAC CAC CAA GCC-31,下游引物：5'-CTC CTG GTA TGA AAT GGC AAA-3'。按照按SYBRpremixExTa說明書進(jìn)行反應(yīng),實時熒光定量利用PCR技術(shù)通過2-ΔΔCT方法分析相對基因表達(dá)差異數(shù)據(jù)分析。GAPDH作為內(nèi)參。7、統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,組間比較采用ONE-WAY方差分析,多重比較用LSD-t檢驗。以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：(1)免疫組化結(jié)果顯示UUO術(shù)后7天模型組大鼠梗阻側(cè)腎臟可見大量炎癥細(xì)胞侵潤；腦腸肽治療組間質(zhì)炎癥細(xì)胞侵潤明顯減少。(2)UUO術(shù)后7天模型組大鼠梗阻側(cè)腎臟炎癥及趨化因子(IL-1β、MCP1、 TNF-α) mRNA的表達(dá)水平明顯升高；腦腸肽治療組炎癥及趨化因子mRNA的表達(dá)水平顯著下降。(3)UUO術(shù)后7天模型組大鼠梗阻側(cè)腎臟p-p65表達(dá)水平明顯增高；腦腸肽治療組p-p65表達(dá)水平顯著下降。(4) TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)染色結(jié)果顯示UUO術(shù)后7天模型組大鼠梗阻側(cè)腎臟腎小管上皮細(xì)胞(Tubular epithelial cells, TECs)凋亡細(xì)胞明顯增多；腦腸肽治療組凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。結(jié)論：(1)腦腸肽能夠通過抑制炎癥及趨化因子的表達(dá),從而抑制炎癥細(xì)胞侵潤,進(jìn)而有效減輕梗阻側(cè)腎臟的炎癥反應(yīng)。(2)腦腸肽能通過減少腎TECs凋亡,進(jìn)而減輕腎臟損傷。
【關(guān)鍵詞】：腎臟 輸尿管梗阻 腦腸肽 炎癥 纖維化
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R692
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 第一章 腦腸肽對UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化影響及機(jī)制19-54
• 1 前言19-22
• 2 實驗材料22-26
• 3 實驗方法26-36
• 4 統(tǒng)計學(xué)方法36
• 5 結(jié)果36-49
• 6 討論49-53
• 7 結(jié)論53-54
• 第二章 腦腸肽對纖維化炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制54-74
• 1 前言54-55
• 2 實驗材料55-58
• 3 實驗方法58-66
• 4 統(tǒng)計學(xué)方法66
• 5 結(jié)果66-71
• 6 討論71-73
• 7 結(jié)論73-74
• 參考文獻(xiàn)74-81
• 英文對照與縮略詞表81-83
• 成果83-84
• 致謝84-85

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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2 劉聰;李宏;李蓉;粟永萍;;Ghrelin對放燒復(fù)合傷大鼠的救治作用[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2014年03期

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本文編號：906800