本文關鍵詞：腎缺血再灌注損傷中miRNA表達譜篩選及miR-98調控HUVEC凋亡的作用

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【摘要】：第一部分大鼠腎臟缺血再灌注損傷時miRNA表達譜的篩查[研究目的]通過基因芯片篩選大鼠腎臟缺血再灌注損傷后miRNAs表達譜的變化并分析。[研究方法]1、構建SD大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型：大鼠經(jīng)適應性飼養(yǎng)1周后,禁食約12h,腹腔麻醉并消毒后,經(jīng)腹正中線切開皮膚、腹膜,充分暴露雙側腎蒂,使用無創(chuàng)微型血管夾迅速夾閉雙側腎蒂,傷口覆蓋鹽水紗布,恒溫燈保持腹部體溫,45mmin后同時松開血管夾,縫合腹膜和皮膚。大鼠造模12h后,再次麻醉大鼠,收集標本。2、實驗分組：10周齡大鼠12只隨機分為兩組,每組6只：①實驗組：雙側腎臟血管夾夾閉45分鐘后再灌注12小時后收集標本；②假手術組：同樣的方法游離暴露雙側腎蒂,直接覆蓋鹽水紗布后等待45mmin,12h后逐層縫合切口。3、標本收集和檢測方法：心臟穿刺取血,檢測血清肌酐與尿素氮,同時取腎臟利用microRNA芯片技術檢測腎臟缺血再灌注時miRNA的表達變化,最后通過RT-PCR驗證芯片檢測結果。[結果]1、成功構建大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型,缺血再灌注損傷后血清肌酐和尿素氮水平明顯升高。2、通過microRNAs芯片結果觀察到大鼠腎臟缺血再灌注損傷后36條miRNAs出現(xiàn)明顯的表達變化,其中有15條miRNAs表達差異超過兩倍。通過RT-PCR驗證與miRNAs芯片結果一致,其中10條miRNAs表達上調,5條miRNA表達下調,表達上調的分別是：miR-98、miR-196a、miR-146b、miR-292-5p、 miR-132、miR-327、miR-374、miR-290、miR-352、和miR-894,下調的miRNA是：miR-145、miR-29a、miR-329、miR-140和miR-375。[結論]大鼠腎臟缺血再灌注損傷時miRNA表達譜發(fā)生明顯變化,可能通過炎癥激活、細胞凋亡與增殖、血管形成和間質纖維化等參與腎臟缺血再灌注損傷的發(fā)生與發(fā)展,具體機制有待進一步研究證實。第二部分缺氧復氧損傷時HUVEC中miR-98的表達變化及其通過靶基因Caspase-3對細胞凋亡的調控[研究目的]體外探討微血管內(nèi)皮細胞在缺氧復氧損傷后miR-98表達水平的變化及其對細胞凋亡的影響,并探討可能的機制。[研究方法]1、培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC),構建體外的缺氧復氧模型,通過輕質石蠟油覆蓋細胞表面模擬缺血刺激。60min后,加入無血清無糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。在不同時間點收集細胞,用RT-PCR法檢測檢測miR-98的表達。2、HUVEC轉染miR-98 inhibitor和Mimics及相應的對照,抑制或過表達miRNA;在缺氧復氧模型,在mRNA水平和蛋白質水平檢測潛在靶基因caspase-3的表達變化,流式細胞儀和TUNEL檢測細胞凋亡情況。3、通過生物信息學檢索,明確miR-98和caspase-3的3'端UTR區(qū)的堿基互補序列。并構建3UTR (Casp3)報告基因載體和3UTR (Casp3) mut報告基因載體。目的基因3'UTR區(qū)域構建至載體中報告基因螢光素酶的后面,通過比較過表達miRNA后,報告基因表達的改變定量反映miRNA對目的基因的抑制作用。[結果]1、HUVEC缺氧復氧后miR-98表達4h即出現(xiàn)上升；24h時表達升至對照組5倍。2、體外轉染miR-98 inhibitor后,發(fā)現(xiàn)Caspase-3與miR-98之間存在明顯的負相關現(xiàn)象。3、成功構建3UTR(Casp3)報告基因載體和3UTR(Casp3) mut報告基因載體(突變模式為CTACCTCA突變?yōu)锳ACAUCGA; miR-98可調節(jié)CASP3 3'UTR的luciferase的表達(p0.0001)。[結論]1、HUVEC缺氧復氧損傷后出現(xiàn)miR-98的表達上升。2、miR-98的表達對IRI損傷后HUVEC中capase-3和細胞凋亡有負向調節(jié)作用。說明miR-98可對缺氧復氧損傷后的微血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生一定的保護作用。3、Caspase-3為miR-98的靶基因。
【關鍵詞】：microRNA 缺血再灌注損傷 急性腎損傷 生物標記物 microRNA 缺血再灌注損傷 微血管內(nèi)皮細胞 caspase-3
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R692
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 主要英文縮略詞12-14
• 前言14-16
• 第一部分 大鼠腎臟缺血再灌注損傷時miRNAs表達譜的篩查16-27
• 材料和方法16-21
• 統(tǒng)計學分析與處理21-22
• 結果22-25
• 討論25-26
• 小結26-27
• 第二部分 缺氧復氧損傷時HUVEC中miR-98的表達變化及其通過靶基因Caspase-3對細胞凋亡的調控27-48
• 材料和方法27-36
• 統(tǒng)計學分析與處理36-37
• 結果37-45
• 討論45-48
• 全文總結48
• 主要結論48-49
• 綜述49-56
• 參考文獻56-64
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況64-65
• 致謝65

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