本文關(guān)鍵詞：石蒜堿對腎癌細(xì)胞786-O、ACHN的作用及機(jī)制初探

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【摘要】：研究背景腎癌是一個復(fù)雜的異質(zhì)性疾病,腎透明細(xì)胞癌是最常見的分型,并且占腎實(shí)質(zhì)性腫瘤大約75%。早期局部腎癌病人在手術(shù)切除病灶后預(yù)后較好,但是,近30%的病人在初診時就發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)移灶。與其它實(shí)質(zhì)性腫瘤相比,腎癌病人往往對放療和化療耐受,免疫治療對已發(fā)生轉(zhuǎn)移的晚期患者有一定的療效。腎癌在男性的發(fā)病率高于女性,其比例約為2：1,最常發(fā)病于50-70歲年齡段。雖然我國的發(fā)病率低于全球平均水平,但2012年我國新發(fā)型66466例,約為美國新診斷病例的兩倍,此差異可能源于環(huán)境的暴露和遺傳傾向。我國腎癌在男性的發(fā)病率居所有腫瘤發(fā)病率的第七位。隨著檢查手段的不斷進(jìn)步,其發(fā)病率以每年大約2%的速率增長。基于目前的檢測手段,25-40%的腎癌為偶發(fā)腎癌,25～30%的病人在初診時就發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)移灶的存在,且部分患者發(fā)生了亞臨床轉(zhuǎn)移。手術(shù)切除是治愈早期診斷腎癌的主要手段。初診時就已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移的患者其中位生存期不足一年。腎癌對放、化療均不敏感,故對于已發(fā)生局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移腎癌的治療手段有限。開始于上世紀(jì)90年的以中、高劑量IL-2為基礎(chǔ)的細(xì)胞因子治療客觀反應(yīng)率不足30%。在西方國家,靶向治療是晚期腎癌主要的治療手段。腎癌靶向治療主要有兩類治療藥物,一類是酪氨酸酶抑制劑(TKIs)靶向腫瘤血管和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制劑。索拉非尼是第一個獲準(zhǔn)用于治療IV期腎癌并推薦為一線或二線治療的TKIs。其它包括舒尼替尼、依維莫司及阿西替尼在內(nèi)各類靶向藥物均存在價格昂貴或國內(nèi)人群臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果資料尚不完備等問題。[1]長期以來,尋找對腎癌敏感的藥物都是科研工作者及醫(yī)務(wù)人員感興趣的問題。石蒜堿(lycorine,分子量287.313)最早由日本人森島庫太1937年從傳統(tǒng)中藥石蒜的鱗中分離得到的一種芐基苯乙胺類生物堿�；钚匝芯勘砻�,石蒜堿及其衍生物具有抗炎、抗病毒、抗瘧疾、抗寄生蟲、抑制乙酰膽堿酯酶、保護(hù)心血管及抗腫瘤、及最近發(fā)現(xiàn)的抑制破骨細(xì)胞生成等多種生物學(xué)作用。近年來,國內(nèi)外合成了很多石蒜堿衍生物,如鹽酸石蒜堿(Lycorine hydrochloride)、氧化石蒜堿(Lycobetaine)、二氫石蒜堿(Dihydrolycorine)、偽石蒜堿(Pseudolycorine)及其它一些做過結(jié)構(gòu)修飾尚未命名的化合物。并對石蒜堿在各種腫瘤的作用及機(jī)制做了較多研究。目前未見石蒜堿對腎癌細(xì)胞較系統(tǒng)的研究。目的探討石蒜堿對腎癌細(xì)胞786-O及ACHN的作用,觀察兩株不同惡性程度的腎癌細(xì)胞株的生物學(xué)行為改變,探索其可能的作用機(jī)制；為腎癌的治療尋找新的思路。方法1.石蒜堿對腎癌細(xì)胞株786-O和ACHN生物學(xué)行為的影響1.1流式細(xì)胞儀分析石蒜堿對786-O及ACHN細(xì)胞周期及凋亡的影響取對數(shù)生長期的細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為3×105mL,接種細(xì)胞到6孔板內(nèi),放人37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜,待其長至50%匯合度時取出6孔板,吸盡培養(yǎng)液,依次加人預(yù)先配制好的濃度分別為0、1、2、5、10、25μmol/L的石蒜堿溶液2mL于準(zhǔn)備處理的細(xì)胞中,培養(yǎng)24h后,收集細(xì)胞及其上清液,送孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院流式細(xì)胞室檢測,同時凋亡檢測及細(xì)胞周期分析。1.2 MTS檢測石蒜堿對786-O及ACHN細(xì)胞增殖的作用取對數(shù)生長期的細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度并接種到96孔板,使達(dá)到2×103個/孔。設(shè)空白組和石蒜堿處理組,每組5個復(fù)孔。放人37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),待貼壁后換液并對石蒜堿組加藥處理。分別于加藥后0h、24h、48h、72h、96h各時間點(diǎn)加入20ul MTS,37℃孵育1h后,用酶標(biāo)儀測490nm處OD值。1.3劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測石蒜堿對786-0及ACHN細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響用記號筆在六孔板底做記號,培養(yǎng)細(xì)胞至匯合度達(dá)90%以上,用中槍頭在長滿細(xì)胞的六孔板中劃痕,注意比照板底記號,并于劃痕后換液(處理組加藥)。分別在劃痕后12h、24h、36h拍照,用Image-Pro Plus 6.0軟件計算不同時間點(diǎn)劃痕寬度。實(shí)驗(yàn)設(shè)三個復(fù)孔。取對數(shù)生長期細(xì)胞,設(shè)空白組和石蒜堿組(5μmol/L),無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后(石蒜堿組加0.5μmol/L預(yù)處理)胰酶消化制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.5x105/mL。將4℃過夜融化的基質(zhì)膠稀釋后加入Transwell小室,37℃溫育30min,取200u1細(xì)胞懸液加入小室,并避免產(chǎn)生氣泡(遷移實(shí)驗(yàn)則不加基質(zhì)膠)。24孔板相應(yīng)孔加入600u1含15%FBS的RPMI-1640,培養(yǎng)48h后終止。PBS洗小室兩遍,棉簽拭去殘留基質(zhì)膠。先將小室置4%多聚甲醛溶液固定15mmin,再放入0.1%結(jié)晶紫染色液染色20min,最后以PBS清洗小室內(nèi)和底部殘留染色液,晾干后于倒置顯微鏡下觀察拍照,并采用人工計數(shù)法,取四個隨機(jī)視野統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)。1.4平板克隆形成檢測石蒜堿對786-O及ACHN細(xì)胞集落形成能力的影響取對數(shù)生長期細(xì)胞,以200/孔的密度接種到六孔板中。待細(xì)胞貼壁后換液并按正常對照組、5μmol/L石蒜堿組加藥處理,靜置生長10天后終止培養(yǎng)。用PBS緩慢清洗2遍后加入4%多聚甲醛固定10min,加入0.1%結(jié)晶紫染色15mmin,吸去染色液,風(fēng)干并拍照。人工計數(shù)法計數(shù)細(xì)胞數(shù)大于50個的集落。2.石蒜堿對腎癌細(xì)胞株786-O作用的機(jī)制2.1用DCF-DA檢測石蒜堿處理后786-O細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化2.1.1接種細(xì)胞：使用96孔板,每孔接種1.5萬個細(xì)胞。孵育DCFH-DA:接種24小時后用PBS液洗兩遍,并換上終濃度為25μMDCFH-DA的RAPI-1640,培養(yǎng)箱孵育30 min.2.1.2結(jié)束DCFH-DA孵育后,吸棄培養(yǎng)基,用PBS液小心洗兩遍。2.1.3檢測并拍照：Zeiss倒置顯微鏡檢測熒光。488nm激發(fā)波長,525nm發(fā)射波長。2.2實(shí)時熒光定量PCR檢測石蒜堿處理后經(jīng)典凋亡通路及NF-κB通路基因轉(zhuǎn)錄水平的變化Primerbank(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)查找相關(guān)基因引物,并委托上海生工公司合成引物�？俁NA提取。逆轉(zhuǎn)錄合成相關(guān)基因cDNA。實(shí)時熒光定量PCR.采用2-△△T法分析基因的相對表達(dá)量2.3 Western-blot分析相關(guān)通路蛋白的變化蛋白提取于4℃、x1000 rpm條件下離心5 min后收集各分組不同濃度石蒜堿處理的細(xì)胞,加入蛋白提取液200ul,1%Triton,150 mM NaCl,25 mM Tris-HC1(pH7.2), 0.5mM EDTA,0.5mM Na3VO及蛋白酶抑制劑雞尾酒片震蕩混勻,冰上放置30min,4℃、×12000rpm離心30min,取上清。蛋白濃度測定及分裝用BCA蛋白定量法測定各分組蛋白含量,按計算結(jié)果加5×上樣緩沖液和去離子水。95℃,5 min,放-80℃保存?zhèn)溆谩Ｅ淠z及電泳根據(jù)蛋白分子量不同,配制8-12%的膠。各泳道取各分組蛋白標(biāo)本20-50ug,并加入2-4ul marker進(jìn)行常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳,每次電泳各泳道上樣量應(yīng)一致。電轉(zhuǎn)及抗體反應(yīng)轉(zhuǎn)膜,BSA封閉,然后依次進(jìn)行一抗和二抗反應(yīng)。P-actin作為內(nèi)對照。一抗二抗反應(yīng)完均應(yīng)用TBST漂洗3次,每次5min�；瘜W(xué)發(fā)光、拍照根據(jù)試劑盒說明書配制免疫化學(xué)發(fā)光顯色液。上機(jī)曝光,拍照。并用QuantityONE軟件進(jìn)行灰度值分析。結(jié)果1.石蒜堿對腎癌細(xì)胞株786-O和ACHN細(xì)胞生物學(xué)行為的影響1.1石蒜堿對ACHN和786-O半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為24.3μmol/L、 11.3μmol/L。1.2石蒜堿能將腎癌786-O細(xì)胞劑量依賴性阻滯于S期(p0.05),能將ACHN細(xì)胞阻滯于G0/G1期(p0.01)。1.3與正常對照組相比,5μmol/L石蒜堿即能誘導(dǎo)786-O及ACHN細(xì)胞凋亡(p0.05；p0.01)、抑制786-0及ACHN細(xì)胞增殖(p0.01；p0.01)。處理后786-O細(xì)胞遷移能力(p0.01)、侵襲能力(p0.01)顯著下降、集落形成能力呈劑量依賴性降低(p0.05)；ACHN細(xì)胞遷移能力(p0.01)、侵襲能力(p0.01)顯著下降、集落形成能力亦呈劑量依賴性降低(p0.05)。2.石蒜堿對腎癌細(xì)胞株786-O作用的機(jī)制研究2.1 5uM石蒜堿處理786-O細(xì)胞后24h,倒置熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),正常對照組和實(shí)驗(yàn)組均可見到綠色熒光,不同的是,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)基本已變?yōu)橘N壁不牢的圓球形,熒光明亮,而正常對照組,細(xì)胞仍為貼壁緊密的梭形,熒光較暗。2.2 5uM石蒜堿處理786-O細(xì)胞后,實(shí)時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),CDK4、 CyclinD1、CyclinD2、JNK、ERK1/2、IKB-α、P90RSK、和等基因表達(dá)下降；P53、MSK、STAT3、p38、AKT、以及RELA表達(dá)升高。2.3在786-O細(xì)胞Western-blot結(jié)果顯示5μmol/L的石蒜堿即能上調(diào)Bax、 p-AKT、p-Bad、p-p38、p-ERK表達(dá),而下調(diào)CDK4、 CyclinD1、Bcl-2、survivin、 p-P65、IKBα的表達(dá)。而p21,JNK、p38、IKKα、p65、pIKB-α等蛋白水平則變化不大。結(jié)論1.石蒜堿對腎癌786-O、ACHN細(xì)胞均有生長抑制作用；對786-O的生長抑制作用更明顯。2.石蒜堿對腎癌786-O、ACHN細(xì)胞均有凋亡誘導(dǎo)作用；對786-O的凋亡誘導(dǎo)作用更強(qiáng)。石蒜堿能抑制腎癌786-O、ACHN細(xì)胞遷移、侵襲；3.石蒜堿能抑制腎癌786-O、ACHN細(xì)胞集落形成能力；4.石蒜堿可能通過刺激細(xì)胞ROS集聚、凋亡途徑及NF-κB信號通路發(fā)揮對786-O的抗腫瘤作用�？傊�,石蒜堿對腎癌細(xì)胞具有明顯的抗腫瘤效應(yīng)。比較而言,石蒜堿對786-O作用較對ACHN細(xì)胞更強(qiáng),二者抗腫瘤的機(jī)制并不完全相同,這可能和細(xì)胞株本身的惡性程度不同有關(guān)。該藥可為腎癌的化療或其輔助治療提供新思路。
【關(guān)鍵詞】：腎癌 石蒜堿 活性氧簇 凋亡 核轉(zhuǎn)錄因子κB
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.11
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-16
• 前言16-18
• 第一章 石蒜堿對腎癌786-O、ACHN細(xì)胞株的作用18-29
• 1. 材料與方法18-21
• 2. 結(jié)果21-28
• 3. 結(jié)論28-29
• 第二章 石蒜堿對腎癌786-O細(xì)胞株作用機(jī)制初探29-48
• 1. 材料與方法29-39
• 2. 結(jié)果39-42
• 3. 討論42-47
• 4. 結(jié)論47-48
• 全文總結(jié)48-49
• 參考文獻(xiàn)49-53
• 綜述53-64
• 參考文獻(xiàn)62-64
• 主要中英文詞匯對照表64-65
• 攻讀學(xué)位期間成果65-66
• 致謝66-67

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 吳志平;陳雨;馮煦;夏冰;;石蒜科藥用植物生物堿的藥理學(xué)研究[J];中國野生植物資源;2008年05期

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本文編號：732299