本文關(guān)鍵詞：CRISP2蛋白在弱精癥精液精子中表達下調(diào)的分子機制及其臨床意義

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【摘要】：不孕不育已逐漸成為全球性的健康問題,影響著全球15%的育齡夫婦。這些不孕不育夫婦中男性因素占50%,而獲得性和先天性精子異常是男性不育的重要因素。作為精子質(zhì)量異常最常見的類型,弱精癥是引起男性不育主要的因素之一[4]。根據(jù)WHO第五版診斷標(biāo)準,弱精癥是指精液參數(shù)中前向運動的精子率小于32%的病癥,其病因和病理復(fù)雜多樣。許多假說被認為和弱精癥相關(guān),如先天性或獲得性泌尿生殖道異常,內(nèi)分泌紊亂,陰囊溫度異常(精索靜脈曲張),泌尿生殖道感染,睪丸損傷或病變,抗精子抗體或遺傳變異等,但其確切發(fā)病機制目前尚不清楚。近年來許多研究已經(jīng)開始關(guān)注于弱精癥發(fā)生發(fā)展的分子機制。一些差異表達基因,諸如Tekt2, DNAI1, DNAH5, DNAH11, Akap4, Sept和CRISP2 (cysteine-rich secretory protein 2),被認為與弱精癥密切相關(guān)。其中CRISP2,屬于CRISP/antigen5/pathogenesis (CAP)蛋白超家族中的CRISPs家族,因其特殊的定位和功能,引起了較為廣泛的關(guān)注和研究。CRISP2蛋白,作為CRISPs家族中激素非依賴性,且唯一特異性表達于睪丸的蛋白,定位于精子頂體和尾部的外致密纖維鞘。在功能上,CRISP2蛋白通過RyR (ryanodine receptor)受體調(diào)控Ca2+離子通道的活性,參與精子鞭毛運動的調(diào)節(jié)、頂體反應(yīng)和精卵融合等過程�；蛐酒瑪�(shù)據(jù)提示CRISP2與精子的發(fā)生以及男性不育密切相關(guān)。有研究表明CRISP2在弱精癥精液精子中表達下調(diào),并且動物牛中低水平的CRISP2與低的受孕率相關(guān),以上數(shù)據(jù)均提示CRISP2參與弱精癥的發(fā)生發(fā)展。因此,CRISP2在弱精癥患者精液精子中表達下調(diào)的分子機制值得進一步探討�；虻谋磉_通常由遺傳和表觀遺傳學(xué)共同調(diào)控DNA甲基化和micrRNAs (miRNA)調(diào)控作為表觀遺傳學(xué)中兩項重要的調(diào)控機制,參與著許多生物學(xué)過程。目前研究表明異常的DNA甲基化與精子功能低下、少精密切相關(guān)；miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控參與精原細胞的誘導(dǎo)和分化,miRNA表達譜顯示miRNAs廣泛表達于哺乳動物的睪丸,鼠的生殖細胞以及人的精液精子中,提示miRNAs調(diào)控著精子發(fā)生的不同階段。然而,目前仍不清楚DNA甲基化和miRNA調(diào)控是否參與調(diào)控弱精癥CRISP2的低表達。在本研究中,我們將探討弱精癥精液精子中CRISP2的表達情況,CRISP2基因啟動子區(qū)域甲基化的狀態(tài),以及microRNA 27b (miR-27b)調(diào)控CRISP2低表達的機理,同時闡明miR-27b和CRISP2在弱精癥、男性不育的臨床意義。本研究將為弱精癥的發(fā)生機制提供新的理論依據(jù)。方法和結(jié)果：1.弱精癥精液精子中CRISP2蛋白表達下調(diào),而CRISP2基因mRNA表達無差異。通過qRT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測48例弱精癥和42例正常精液精子中CRISP2基因的mRNA和蛋白表達水平,發(fā)現(xiàn)弱精癥精液精子中CRISP2基因的mRNA表達水平和正常組比較無差異(P=0.3854,圖1-3),但CRISP2蛋白卻表達下調(diào)(圖1-4)。2.弱精癥精液精子CRISP2基因啟動子CpG島未發(fā)現(xiàn)甲基化精液精子中包含著早期精子發(fā)生階段的表觀遺傳學(xué)信息,可以通過檢測精液精子中的甲基化狀態(tài)來評估精子發(fā)生階段的甲基化情況。通過甲基化特異和硫化測序性PCR (methylation-specific PCR, MSP)技術(shù)檢測48例弱精癥和42例正常精液精子中PCR (bisulfite-sequencing PCR, BSP)基因啟動子CRISP2CpG島甲基化狀態(tài),均未發(fā)現(xiàn)其啟動子CpG島存在甲基化(圖2-2,2-3,2-4)。3.MiR-27b在弱精癥精液精子中表達升高,并且可以通過靶向結(jié)合miR-27b基因3'-UTR并調(diào)控其表達。CRISP2調(diào)控作為表觀遺傳學(xué)的重要機制,可以通過與靶基因MiRNAs不完mRNA全互補配對而在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達進行負調(diào)控,導(dǎo)致的翻譯抑mRNA制或降解。據(jù)此,我們將探討調(diào)控在弱精癥中miRNA表達的作用。運CRISP2用生物信息學(xué)預(yù)測軟件(包括miRWalk和miRDR, miRWalk數(shù)據(jù)庫)Targetscan預(yù)測可能作用于基因3’-UTR的CRISP2和miRNAs——miR-27a, miR-27b, miR-502-3p, miR-510, miR-640(圖3-3)。通過臨床精液樣本miR-767-5p技術(shù)初步篩選發(fā)現(xiàn)qRT-PCR在弱精癥精液精子中高表達(P=0.0071,miR-27b圖3-4A),隨后在更大臨床樣本中亦證實在弱精癥精液精子中高表達miR-27b(P=0.0013,圖3-5),提示弱精癥中和miR-27b密切相關(guān)。CRISP2為進一步探討對miR-27b的靶向調(diào)控作用,我們構(gòu)建搭載CRISP2基因3'-UTR的CRISP2熒光質(zhì)粒,然后通過293T細胞體外共轉(zhuǎn)染pEZX-MT05質(zhì)粒和pEZX-MT05檢測熒光信號強度。結(jié)果顯示miR-27b mimic,可miR-27b以明顯抑制搭載基因3'-UTR的CRISP2質(zhì)粒的熒光強度,提示pEZX-MT05是miR-27b的靶基因,CRISP2可能通過抑制miR-27b參與弱精癥的發(fā)CRISP2生。為了證實我們的結(jié)果,我們通過293T細胞分別體外轉(zhuǎn)染miR-27b mimic、 inhibitor、 NC mimic或miR-27b mimic + CRISP2質(zhì)粒,Western Blot技術(shù)檢測CRISP2蛋白表達水平(圖3-7),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-27b mimic組CRISP2蛋白表達下調(diào)；轉(zhuǎn)染miR-27b inhibitor組CRISP2蛋白表達升高；轉(zhuǎn)染miR-27b mimic+ CRISP2質(zhì)粒組,CRISP2蛋白恢復(fù)表達。此外,運用Spearman's相關(guān)性分析臨床樣本中miR-27b和CRISP2蛋白的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)精液精子中miR-27b的表達水平和CRISP2蛋白的表達水平呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.5039,P=0.0121；圖3-8)。然而,沒有證據(jù)顯示miR-27b的表達水平和CRISP2基因的mRNA表達水平有相關(guān)性(P0.05,圖3-9),這結(jié)果與前期研究中,CRISP2基因mRNA在兩組樣本(弱精癥和正常精液精子)中表達無差異的結(jié)果相一致。綜上所述,miR-27b可以直接調(diào)控CRISP2的表達。4. MiR-27b和CRISP2蛋白與前向運動精子率、形態(tài)正常精子率、不育密切相關(guān)。為了進一步分析miR-27b和CRISP2蛋白與弱精癥的關(guān)系,我們分析了臨床樣本中miR-27b、CRISP2蛋白與前向運動精子率、形態(tài)正常精子率的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)在90位參與者(48例弱精癥患者和42例正常志愿者)中miR-27b的表達水平和前向運動精子率呈負相關(guān)(r=-0.2745,P=0.0088；圖4-1),和形態(tài)正常精子率呈負相關(guān)(r=-0.3397,P=0.0012；圖4-2)。此外,在其中的24位參與者(12例弱精癥患者和12例正常志愿者)中CRISP2蛋白的表達水平和前向運動精子率呈正相關(guān)(r=0.6697,P=0.0003；圖4-3),和形態(tài)正常精子率呈正相關(guān)(r=0.5911,P=0.0024；圖4-4)。最后,對90位參與者進行為期1年的婚育史隨訪調(diào)查研究。將63位有效回訪者根據(jù)其miR-27b或CRISP2蛋白的表達水平分別分為miR-27b相對高表達組和miR-27b相對低表達組,以及CRISP2蛋白相對高表達組和CRISP2蛋白相對低表達組。分別計算各組的不育率,采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗分析不同分組間不育率的差異(圖4-5)。弱精癥組的不育率明顯高于正常對照組(32%,P=0.0038,表4-3),miR-27b相對高表達組的不育率明顯高于miR-27b相對低表達組(P=0.0376,表4-4),CRISP2蛋白相對低表達組的不育率明顯高于CRISP2蛋白相對高表達組(P=0.0335,表4-5),提示低表達的CRISP2蛋白、高表達的miR-27b與不育密切相關(guān)。MicroRNA是生物體內(nèi)源長度約為20-23個核苷酸的非編碼小RNA,通過與靶基因mRNA的3'-UTR不完全互補配對而在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達進行負調(diào)控,導(dǎo)致mRNA的翻譯抑制或降。精子miRNAs被認為參與調(diào)控精子發(fā)生的不同階段。通過microRNAs芯片技術(shù),分別在不同類型的精子發(fā)生受損的患者精液精子中發(fā)現(xiàn)許多差異表達miRNAs。特別地,Ji等發(fā)現(xiàn)在精索靜脈曲張患者的精液精子中miR-15a能靶向結(jié)合HSPA1B并抑制其蛋白的表達,起著在精子成熟過程中對抗熱應(yīng)激反應(yīng)的保護作用。目前普遍認為miRNAs是精子發(fā)生過程中的殘留物,可以通過精子的miRNAs反應(yīng)精子發(fā)生、精原細胞增殖、分裂過程的miRNAs情況；但亦有不同觀點認為這些精子中的miRNAs可以在隨后的受精過程中傳遞給卵細胞發(fā)揮調(diào)控功能。在我們的研究中,我們發(fā)現(xiàn)miR-27b可能調(diào)控CRISP2基因的表達,并通過生物信息學(xué)預(yù)測、臨床樣本篩選、熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)、293T細胞體外轉(zhuǎn)染miRNAs、精液樣本中miR-27b和CRISP2相關(guān)性分析等一系列研究首次證實miR-27b可以通過直接靶向結(jié)合CRISP2基因3'-UTR并抑制其蛋白的表達。MiR-27b,在許多腫瘤中被認為是一種腫瘤抑制因子[63-65],可以抑制炎癥反應(yīng)、血管生成以及介導(dǎo)脂肪生成障礙、線粒體損傷。miRNA芯片數(shù)據(jù)顯示miR-27b廣泛表達于睪丸、卵巢以及受精卵,并且高表達于弱精癥患者精液精子,提示在不同的精子發(fā)生過程中,miR-27b可能是一個重要的調(diào)節(jié)因子。研究報道,CRISP2廣泛表達并參與精子發(fā)生、睪丸后精子成熟等不同階段。許多研究顯示CRISP2參與睪丸中Sertoli支持細胞間的粘附,特異性表達于睪丸,定位于精子的頂體和尾部,最終通過頂體反應(yīng)或與頂體赤道段的再關(guān)聯(lián)反應(yīng)參與受精過程。特別地,基于基因芯片數(shù)據(jù)的分析提示CRISP2的異常表達與精子發(fā)生阻滯、功能缺失相關(guān)。更為有趣的是,盡管目前普遍認為精子在翻譯水平是沉默的,但Yael Gur和Haim Breitbart證實哺乳動物精子在受精前發(fā)生了蛋白質(zhì)的表達。這與我們觀察到的結(jié)果相一致——弱精癥精液精子中CRISP2基因mRNA表達水平無差異,而蛋白則表達下調(diào)。綜上所述,CRISP2及其特異性調(diào)節(jié)因子miR-27b可能參與了精子發(fā)生、成熟、受精前等過程,盡管需要后續(xù)更多的研究數(shù)據(jù)支持。弱精癥是指精子活力低下的病癥,臨床上常伴隨著精子密度低下和精子畸形率升高。精子活力低下是導(dǎo)致男性不育的重要因素,而精子的活力和自然受孕率又密切相關(guān);文獻報道在動物牛精液精子中低表達的CRISP2將會引起低的受孕率。因此,為探討miR-27b和CRISP2在弱精癥、男性不育中的臨床意義,我們分析了miR-27b和CRISP2與精液基本參數(shù)的相關(guān)性,并對所有參與者進行了為期1年的婚育史隨訪調(diào)查研究,發(fā)現(xiàn)精液精子中高表達的miR-27b、低表達的CRISP2蛋白和低的前向運動精子率、形態(tài)正常精子率密切相關(guān),隨訪研究結(jié)果亦顯示弱精癥組的不育率高于正常對照組,高表達的miR-27b、低表達的CRISP2蛋白和高的不育率密切相關(guān)。盡管可能存在更多的miR-27b靶基因參與弱精癥、男性不育的發(fā)生,但我們的研究揭示了在精子發(fā)生到受精前,miR-27b可能通過抑制CRISP2蛋白的表達,影響精子的活力和形態(tài),進而參與弱精癥、男性不育的發(fā)生發(fā)展。本研究闡明了弱精癥精液精子中CRISP2蛋白表達下調(diào)的一種新機制,為男性不育的靶向性治療以及男性避孕的可能提供了理論基礎(chǔ)。結(jié)論：1.弱精癥精液精子中CRISP2蛋白表達下降,而mRNA表達水平未見改變,提示CRISP2基因的表達可能不受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,并且低表達水平的CRISP2蛋白與弱精癥關(guān)系更密切。2.弱精癥和正常精液精子中均未發(fā)現(xiàn)CRISP2基因啟動子CpG島存在甲基化,提示DNA甲基化不參與弱精癥中CRISP2表達的調(diào)控,CRISP2蛋白表達下調(diào)可能受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制影響。3. miR-27b在弱精癥精液精子中高表達,并且可以通過直接靶向結(jié)合CRISP2基因3’-UTR并抑制其蛋白的表達。4. miR-27b可能通過靶向結(jié)合CRISP2基因3’-UTR并抑制其蛋白的表達,影響精子的活力和形態(tài),進而參與弱精癥、男性不育的發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：弱精癥 富含半胱氨酸的分泌蛋白2(CRISP2) 男性不育 miR-27b
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R698.2
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-33
• References29-33
• 第一章 弱精癥精液精子中CRISP2基因及蛋白的表達分析33-48
• 1 材料與方法33-42
• 2 結(jié)果42-45
• 3 討論45-46
• 4 參考文獻46-48
• 第二章 弱精癥精液精子中CRISP2基因啟動子CpG島甲基化分析48-57
• 1 材料與方法48-52
• 2 結(jié)果52-55
• 3 討論55
• 4 參考文獻55-57
• 第三章 弱精癥精液精子中差異表達的miR-27b在CRISP2基因表達中的調(diào)控作用分析57-73
• 1 材料與方法57-62
• 2 結(jié)果62-68
• 3 討論68-70
• 4 參考文獻70-73
• 第四章 弱精癥精液精子中miR-27b和CRISP2在男性不育中的臨床意義73-82
• 1 材料與方法73-74
• 2 結(jié)果74-80
• 3 討論80-81
• 4 參考文獻81-82
• 全文小結(jié)82-84
• 英文縮寫注解84-85
• 攻讀學(xué)位期間成果85-86
• 致謝86-87

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

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本文編號：698443