本文關(guān)鍵詞：新型PPARγ激動劑對人腎癌細(xì)胞增殖抑制及其機(jī)制的研究

  更多相關(guān)文章： 腎細(xì)胞癌 PPARγ受體激動劑 細(xì)胞增殖 周期阻滯 凋亡

【摘要】：研究目的:過氧化物酶體增生物激活受體γ(peroxisome proliferator-actived receptors gamma,PPARγ)屬于核受體超家族一份子,表達(dá)于心、肝、腎、骨骼肌、卵巢和胎盤等多種人體組織中。自從上個世紀(jì)以來,以PPARγ為靶點(diǎn)的藥物,尤其是噻唑烷二酮類PPARγ激動劑(TZDs),為糖尿病的臨床預(yù)防和治療提供了新的思路。近年來研究發(fā)現(xiàn),PPARγ除了對人體的糖脂代謝具有重要意義外,還與肺,乳腺,結(jié)腸,前腺、膀胱和腎臟等部位的腫瘤關(guān)系密切。在腎癌中,PPARγ激動劑能夠顯著抑制腎癌細(xì)胞增殖,減輕化療藥的腎毒性,有望成為臨床治療腎癌的新藥。然而,自TZDs類藥物上市以來,其肝毒性、致水鈉潴留及增加心衰發(fā)生率等嚴(yán)重副作用限制了該類藥物的長期使用。因此,尋找取代TZD類的新型PPARγ激動劑,對于腎癌的藥物研發(fā)具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。為此,我們與中科院上海藥物研究所合作,通過計算機(jī)虛擬篩選方法獲得的1種新型PPARγ激動劑DH9。前期體外腫瘤學(xué)研究發(fā)現(xiàn),DH9的PPARγ受體激動能力較弱,但卻顯示出比TZDs類更強(qiáng)的抗腫瘤活性。荷瘤裸鼠模型(MGC-803、NCI-H460)上研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),化合物DH9對體重及重要臟器影響較小,適合長期給藥,具有治療腎癌的潛在優(yōu)勢,值得進(jìn)一步探索研究。本研究利用體外培養(yǎng)的腎癌細(xì)胞系OS-RC-2細(xì)胞,探討新型PPARγ激動劑DH9能否在體外發(fā)揮較強(qiáng)的抗腎癌細(xì)胞活性,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究其作用機(jī)制,為將來臨床上開發(fā)更加安全有效的抗腎細(xì)胞癌新藥夯實(shí)理論基礎(chǔ)。研究方法:1.予不同濃度的DH9(0、6.25、12.5、25、50和100μmol/L)或羅格列酮(0、25、50、100、150和200μmol/L)分別干預(yù)人腎癌OS-RC-2細(xì)胞24、48和72小時,MTT檢測OS-RC-2細(xì)胞增殖情況。采用相同濃度(0、6.25、12.5、25、50和100μmol/L)的DH9和羅格列酮干預(yù)OS-RC-2細(xì)胞48小時,MTT檢測細(xì)胞增殖情況。2.予PPARγ特異性拮抗GW9662預(yù)處理人腎癌OS-RC-2細(xì)胞2小時,再加入不同濃度的DH9(0、6.25、12.5、25、50和100μmol/L)干預(yù)48小時,MTT檢測GW9662干預(yù)前后DH9增殖抑制率的變化。為進(jìn)一步驗證PPARγ非依賴途徑參與DH9增殖抑制過程,我們應(yīng)用si RNA技術(shù)抑制PPARγ基因在OS-RC-2細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。PPARγsi RNA轉(zhuǎn)染48小時后收集全細(xì)胞裂解物,Western印跡法觀察細(xì)胞PPARγ表達(dá)的改變。予不同濃度DH9(0、6.25、12.5、25、50和100μmol/L)干預(yù)OS-RC-2細(xì)胞48小時,MTT檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖情況。3.應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù),觀察不同濃度DH9(0、20、40和80μmol/L)作用人腎癌OS-RC-2細(xì)胞48小時后細(xì)胞周期的改變,Western印跡法檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白P27 KIP1及Cyclin D1的變化;采用Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù),測定不同濃度DH9(0、20、40和80μmol/L)干預(yù)下細(xì)胞凋亡率,Western印跡法分析凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)。研究結(jié)果:1.MTT結(jié)果顯示,羅格列酮抑制OS-RC-2細(xì)胞增殖的起效濃度高,起效時間滯后,作用48小時后才能發(fā)揮其增殖抑制效應(yīng)(P0.05)。而DH9的起效濃度較低,作用24小時即可起效,48小時后可顯著抑制腎癌細(xì)胞增殖。此外,相同濃度的羅格列酮及DH9(0、6.25、12.5、25、50和100μmol/L)干預(yù)OS-RC-2細(xì)胞48小時,DH9的增殖抑制作用明顯優(yōu)于羅格列酮(P0.05)。2.GW9662預(yù)處理人腎癌OS-RC-2細(xì)胞增殖2小時后,再予不同濃度DH9作用48小時,MTT結(jié)果顯示PPARγ特異性拮抗劑不能拮抗DH9的增殖抑制效應(yīng)(P0.05)。取不同濃度DH9(0、6.25、12.5、25、50和100μmol/L)處理轉(zhuǎn)染前后的OS-RC-2細(xì)胞48小時,MTT結(jié)果顯示PPARγ小干擾RNA表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對藥物的增殖抑制的影響無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.流式細(xì)胞術(shù)顯示,不同濃度(20、40和80μmol/L)DH9干預(yù)48小時后可干擾細(xì)胞周期。與對照組(0μmol/L)相比,DH9可導(dǎo)致G0/G1期細(xì)胞大量增加(P0.05),S期細(xì)胞大量減少(P0.05),且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,而G2/M期細(xì)胞無明顯變化(P0.05)。Western印跡分析顯示,隨DH9干預(yù)濃度的升高,G1期相關(guān)的cyclin D1蛋白表達(dá)逐漸減弱,而P27 KIP1蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)。4.Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,DH9可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。濃度為20μM、40μM和80μM的DH9作用OS-RC-2細(xì)胞48小時,凋亡率依次為為4.34±0.97%,13.52±0.87%和23.69±1.9%,顯著高于對照組1.81±0.14%(P0.05),且與藥物濃度之間存在一定的依賴關(guān)系。Western印記顯示抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量隨DH9濃度的增加有逐漸減少趨勢,而促凋亡蛋白Bax表達(dá)量隨藥物濃度增加逐漸增多。研究結(jié)論:結(jié)合上述三部分結(jié)果,我們得出結(jié)論:OS-RC-2細(xì)胞中,DH9的增殖作用明顯優(yōu)于羅格列酮,且是通過PPARγ非依賴途徑實(shí)現(xiàn)。這種增殖抑制作用與DH9作用細(xì)胞周期的不同調(diào)節(jié)點(diǎn),促進(jìn)OS-RC-2細(xì)胞凋亡有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：腎細(xì)胞癌 PPARγ受體激動劑 細(xì)胞增殖 周期阻滯 凋亡
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.11
【目錄】：

• 英文縮略表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 第一部分：DH9對人腎癌OS-RC-2細(xì)胞增殖抑制的研究14-23
• 引言14
• 1 實(shí)驗材料14-15
• 2 實(shí)驗方法15-17
• 3 結(jié)果17-21
• 4 討論21-23
• 第二部分：DH9對人腎癌OS-RC-2細(xì)胞周期及凋亡的影響23-32
• 引言23
• 1 實(shí)驗材料23
• 2 實(shí)驗方法23-24
• 3 結(jié)果24-29
• 4 討論29-32
• 結(jié)論32-33
• 參考文獻(xiàn)33-39
• 附錄39-40
• 文獻(xiàn)綜述40-47
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 個人簡歷47-48
• 致謝48

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本文編號：642956