本文關(guān)鍵詞：HPIP在腎癌中的功能研究

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【摘要】：腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)為泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一,發(fā)病率僅次于膀胱癌,位居第二位。早期腎癌常無明顯癥狀,當(dāng)患者出現(xiàn)典型“腰痛、血尿、腹部包塊”癥狀時(shí)多已進(jìn)入臨床晚期。腎癌因其獨(dú)特生物學(xué)特性,常規(guī)放療、化療均難以獲得滿意療效,轉(zhuǎn)移性腎癌患者5年生存率只有大約10%。因此進(jìn)一步明確腎癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,對晚期腎癌的治療策略可能提供潛在的理論依據(jù)。人造血相關(guān)的PBX相互作用蛋白質(zhì)(hematopoietic PBX—interacting protein,HPIP)最早由Abramovich發(fā)現(xiàn),具有調(diào)節(jié)前B細(xì)胞白血病轉(zhuǎn)錄因子(PBXS)的功能。近年來,國內(nèi)外研究團(tuán)隊(duì)相繼撰文顯示,HPIP在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。HPIP在多種腫瘤細(xì)胞系及腫瘤組織中表達(dá),可以通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、遷移和侵襲能力,且在結(jié)腸癌、胃癌中HPIP高表達(dá)提示患者預(yù)后較差,但是目前尚無HPIP在腎癌中功能的報(bào)道。我們前期通過酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn),酪蛋白激酶I?(CK1?)為HPIP的相互作用蛋白之一,進(jìn)一步研究表明HPIP和CK1?在腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。首先,我們選取119例腎癌患者手術(shù)標(biāo)本切片,行免疫組化檢驗(yàn)癌組織和癌旁組織HPIP表達(dá)水平,Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)比較癌組織和癌旁組織間HPIP表達(dá)差異,結(jié)果表明HPIP在腎癌組織中表達(dá)高于癌旁組織;Kaplan-Meier生存曲線顯示:HPIP表達(dá)水平與腎細(xì)胞癌預(yù)后負(fù)相關(guān),HPIP高表達(dá)提示患者預(yù)后較差。接下來,為深入研究CK1?和HPIP在細(xì)胞內(nèi)的相互作用,我們在293T細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染Flag-CK1?和Myc-HPIP質(zhì)粒,Flag beads偶聯(lián)細(xì)胞裂解物,免疫共沉淀后行Western blotting印記發(fā)現(xiàn)Myc-HPIP可以被FLAG-CK1?特異性沉淀下來,初步說明兩者間存在相互作用;之后我們在腎癌細(xì)胞株Caki-1和786O中行內(nèi)源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在生理?xiàng)l件下CK1?和HPIP間同樣存在相互作用,免疫熒光顯示,內(nèi)源性CK1?和內(nèi)源性HPIP共同定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),進(jìn)一步說明了CK1?是?PIP的特異性相互作用蛋白;為進(jìn)一步研究CK1?與?PIP特異性結(jié)合的區(qū)域,我們表達(dá)純化了HPIP各段結(jié)構(gòu)域的GST融合蛋白:GST-HPIP(1 100),GST-HPIP(101 220),GST-HPIP(221 361),GST-HPIP(362 541),GST-HPIP(542 731),與轉(zhuǎn)染了Flag-CK1?的293T細(xì)胞裂解物行GST pull-down實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示CK1?特異性結(jié)合在HPIP(542 731aa)結(jié)構(gòu)域,與HPIP其他結(jié)構(gòu)域不結(jié)合,說明HPIP的C末端區(qū)是與CK1?相互作用的重要區(qū)域。之后我們通過慢病毒感染,在腎癌細(xì)胞株786o中過表達(dá)hpip或hpip(1-541aa),在caki-1中敲低hpip表達(dá),cck8法評估細(xì)胞生長速度,發(fā)現(xiàn)hpip能顯著促進(jìn)786o細(xì)胞生長,而缺失與ck1?相互作用結(jié)構(gòu)域的hpip(1-541aa)對腎癌細(xì)胞生長促進(jìn)不明顯,說明ck1?可能參與了hpip對細(xì)胞生長的調(diào)控作用;另外,敲低hpip表達(dá)能顯著抑制caki-1細(xì)胞生長,而在caki-1中敲低ck1?后,hpip喪失了調(diào)控細(xì)胞生長的功能;用上述細(xì)胞行平板克隆形成實(shí)驗(yàn)取得一致結(jié)果,說明hpip調(diào)控腎癌細(xì)胞生長依賴于和ck1?的相互作用。然后為進(jìn)一步研究hpip和ck1?對腎癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響,我們進(jìn)行了劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell侵襲實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示:過表達(dá)hpip能明顯促進(jìn)腎癌細(xì)胞的遷移和侵襲,而過表達(dá)hpip(1-541aa)對此則無明顯促進(jìn)作用;與此相反,敲低hpip能明顯抑制腎癌細(xì)胞的遷移和侵襲,而敲低ck1?則抑制了hpip調(diào)控腎癌細(xì)胞遷移和侵襲的能力;westernblotting印記顯示:hpip可以下調(diào)e-cadherin表達(dá)水平,同時(shí)上調(diào)n-cadherin和vimentin,hpip(1-541aa)則無明顯作用;敲低hpip后相關(guān)蛋白表達(dá)呈相反變化,并且敲低ck1?后hpip對上述蛋白的調(diào)控能力明顯變?nèi)?說明ck1?在hpip促進(jìn)腎癌細(xì)胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中其重要作用。接下來,為明確hpip調(diào)控腎癌細(xì)胞生長和遷移是否依賴于mtor通路,我們在過表達(dá)hpip的786o和對照組細(xì)胞中加入雷帕霉素(mtor通路抑制劑)處理,生長曲線和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在阻斷mtor通路的情況下,hpip促進(jìn)細(xì)胞生長和遷移的能力明顯下降;westernblotting檢測表明,hpip上調(diào)mtor、p-mtor、p-s6k1表達(dá)水平,而敲低ck1?可以顯著減弱這種調(diào)節(jié)作用,說明hpip通過激活mtor通路參與調(diào)節(jié)腎癌細(xì)胞生長和遷移,且這種激活過程部分依賴于和ck1?的相互作用。再次,我們在腎癌動(dòng)物模型上驗(yàn)證了hpip和ck1?對腫瘤生長的影響,結(jié)果顯示hpip或ck1?敲低后腫瘤生長速度明顯減慢,并且ck1?敲低抑制了hpip對腫瘤生長的調(diào)控作用,腫瘤組織westernblotting檢測結(jié)構(gòu)與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一致。最后,我們在上述119例患者標(biāo)本中行免疫組化檢驗(yàn)癌組織和癌旁組織ck1?表達(dá)水平,行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ck1?在癌組織中高表達(dá),且腫瘤組織中ck1?高表達(dá)提示預(yù)后不良;進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析患者腫瘤組織中ck1?和hpip免疫組化評分,發(fā)現(xiàn)兩者間水平呈正相關(guān),說明ck1?和hpip在腎癌的病理發(fā)展中起重要作用。綜上所述,我們的研究首次發(fā)現(xiàn)了hpip在腎癌中的重要作用,并且篩選并確定了hpip的一個(gè)新的相互作用蛋白:ck1?;ck1?特異性結(jié)合在hpip(542 731aa),在hpip發(fā)揮促進(jìn)腎癌細(xì)胞生長、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等功能中起重要作用;分子機(jī)制方面,hpip激活mtor需要部分依賴于ck1?。因此,進(jìn)一步研究hpip和ck1?在腎癌中的功能及分子機(jī)制,抑制hpip或ck1?表達(dá)可能成為腎癌治療的潛在策略。
【關(guān)鍵詞】：腎細(xì)胞癌 人造血相關(guān)的PBX相互作用蛋白質(zhì) 酪蛋白激酶 預(yù)后
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.11
【目錄】：

• 縮略詞表4-5
• 中文摘要5-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-13
• 材料與方法13-20
• 1.材料13-15
• 2.方法15-20
• 結(jié)果20-33
• 1.RCC中HPIP的表達(dá)及臨床意義20-21
• 2.篩選并確定CK1α為HPIP新的相互作用蛋白21-23
• 3.HPIP通過與CK1α相互作用促進(jìn)腎癌細(xì)胞生長23-25
• 4.HPIP可以促進(jìn)腎癌細(xì)胞CK1α依賴的遷移、侵襲能力和EMT25-27
• 5.HPIP調(diào)控腎癌細(xì)胞生長和遷移部分依賴于CK1α激活的mTOR通路27-29
• 6.動(dòng)物模型中HPIP通過CK1α調(diào)控腎癌細(xì)胞生長和EMT29-30
• 7.RCC中CK1α的表達(dá)及HPIP與CK1α表達(dá)的相關(guān)性30-33
• 討論33-35
• 結(jié)論35-36
• 參考文獻(xiàn)36-39
• 論著39-62
• 個(gè)人簡歷62-63
• 致謝63

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1 馮瀅瀅;HPIP在腸癌中的功能以及機(jī)制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2015年

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1 梅國徽;HPIP在腎癌中的功能研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2016年

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本文編號：574625