本文關(guān)鍵詞：miR-200a調(diào)控β-catenin在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用

  更多相關(guān)文章： miR-200a β-catenin 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化 腎間質(zhì)纖維化

【摘要】：背景和目的:腎間質(zhì)纖維化(renal interstital fibrosis,RIF)是各種不同類型的慢性腎臟病進(jìn)行性發(fā)展的最終結(jié)局。腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial mesenchymal transdifferentiation,EMT)是RIF的重要發(fā)病機(jī)制。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是一個(gè)復(fù)雜、保守的細(xì)胞間生物通路,在生物發(fā)育和疾病中調(diào)控著細(xì)胞功能、表型等。β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子,在不同類型的纖維化疾病中起著重要作用。MicroRNAs(miRNAs)是生物體內(nèi)一類非編碼小RNA,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化與凋亡。近年來(lái)隨著miR-200a在腫瘤方面研究的深入,其在纖維化疾病的作用日益受到重視。有研究報(bào)道m(xù)iR-200a在肝、肺纖維化中起著重要作用,但miR-200a在腎間質(zhì)纖維化中的作用機(jī)制仍不清楚。本課題用TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化,觀察miR-200a和β-catenin的表達(dá)變化;用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)miR-200a以β-catenin的基因CTNNB1為靶標(biāo);以外源性干預(yù)miR-200a的表達(dá),觀察其對(duì)β-catenin和上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響;用干擾RNA阻斷β-catenin表達(dá),反證β-catenin在miR-200a調(diào)控小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的重要作用。確立miR-200a直接以β-catenin為靶點(diǎn)調(diào)控小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。這為干預(yù)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù),為腎間質(zhì)纖維化的治療提供新靶點(diǎn)。方法:1.TGF-β1誘導(dǎo)對(duì)體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞miR-200a和β-catenin的影響,將HK-2細(xì)胞,分為0h組、12h組、24h組、48h組,用終濃度為10ng/ml的TGF-β1分別作用12h、24h、48h;q PCR檢測(cè)各組miR-200a的表達(dá),q PCR和Western Blot檢測(cè)各組HK-2細(xì)胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)情況。2.agomir(miR-200a激動(dòng)劑)和antagomir(miR-200a抑制劑)對(duì)HK-2細(xì)胞miR-200a表達(dá)的影響,HK-2細(xì)胞分為4組:(1)control組:用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞;(2)NC-miRNA組:向細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC-miRNA(陰性對(duì)照miRNA);(3)agomir組:向細(xì)胞轉(zhuǎn)染agomir(50n M);(4)antagomir組:向細(xì)胞轉(zhuǎn)染antagomir(100n M)。48h后q PCR檢測(cè)miR-200a的表達(dá)情況。3.運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(β-catenin基因野生型/突變型,CTNNB1 UTR WT/MT)驗(yàn)證miR-200a與β-catenin的作用靶點(diǎn)關(guān)系,HK-2細(xì)胞分為4組:(1)control組:向細(xì)胞轉(zhuǎn)染CTNNB1 UTR WT/MT質(zhì)粒;(2)NC-miRNA組:向細(xì)胞轉(zhuǎn)染CTNNB1 UTR WT/MT質(zhì)粒和NC-miRNA;(3)antagomir組:向細(xì)胞轉(zhuǎn)染CTNNB1 UTR WT/MT質(zhì)粒和antagomir;(4)agomir組:向細(xì)胞轉(zhuǎn)染CTNNB1 UTR WT/MT質(zhì)粒和agomir。48h后雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光活性。4.上調(diào)miR-200a(agomir)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的β-catenin及小管EMT的影響,HK-2細(xì)胞分為4組:(1)control組:用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)HK-2細(xì)胞;(2)TGF-β1組:用10ng/ml TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞;(3)NC-miRNA+TGF-β1組:向細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC-miRNA并用10ng/ml TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞;(4)agomir+TGF-β1組:向細(xì)胞轉(zhuǎn)染agomir并用10ng/ml TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞。48h后q PCR和Western Blot檢測(cè)細(xì)胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)情況,細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)E-cadherin和α-SMA的表達(dá)情況。5.下調(diào)miR-200a(antagomir)對(duì)β-catenin及小管EMT的影響,HK-2細(xì)胞分為3組:(1)control組:用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞;(2)NC-miRNA組:向細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC-miRNA;(3)antagomir組:向細(xì)胞轉(zhuǎn)染antagomir。48h后q PCR和Western Blot檢測(cè)細(xì)胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)情況,細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)E-cadherin和α-SMA的表達(dá)情況。6.β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞β-catenin的影響,HK-2細(xì)胞分為3組:(1)control組:用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞;(2)NC-siRNA(干擾RNA的陰性對(duì)照)組:向細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC-siRNA;(3)si R-β-catenin組:向細(xì)胞轉(zhuǎn)染β-catenin siRNA。各組細(xì)胞培養(yǎng)至48h進(jìn)行q PCR和Western Blot檢測(cè)β-catenin表達(dá)。7.干擾β-catenin對(duì)antagomir誘導(dǎo)的EMT的影響,HK-2細(xì)胞分為4組:(1)control組:用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞;(2)antagomir組:向細(xì)胞轉(zhuǎn)染antagomir;(3)antagomir+NC-siRNA組:向細(xì)胞轉(zhuǎn)染antagomir和NC-siRNA;(4)antagomir+si R-β-catenin組:向細(xì)胞轉(zhuǎn)染antagomir和β-catenin siRNA。48h后q PCR和Western Blot檢測(cè)細(xì)胞E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:1.TGF-β1誘導(dǎo)下細(xì)胞miR-200a、β-catenin及轉(zhuǎn)分化指標(biāo)的表達(dá)情況q PCR檢測(cè)結(jié)果示miR-200a在0h組呈高表達(dá),在TGF-β1作用12h時(shí)miR-200a表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)(與0h組比,P0.05),48h時(shí)miR-200a表達(dá)最低(與0h組比,P0.05);β-catenin的mRNA和蛋白在0h組呈低表達(dá),24h出現(xiàn)明顯增多(與0h組比,P0.05),48h上升到最高(與0h組比,P0.05)。E-cadherin的mRNA和蛋白在0h組呈高表達(dá),在24h出現(xiàn)明顯降低(與0h組比,P0.05),48h降到最低(與0h組比,P0.05);α-SMA和FN的表達(dá)則與E-cadherin的表達(dá)相反,12h出現(xiàn)明顯上調(diào)(與0h組比,P0.05),在48h表達(dá)最高(與0h組比,P0.05)。提示在TGF-β1誘導(dǎo)小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中miR-200a表達(dá)下調(diào),而β-catenin表達(dá)上調(diào)。2.agomir(miR-200a激動(dòng)劑)和antagomir(miR-200a抑制劑)對(duì)HK-2細(xì)胞miR-200a表達(dá)的影響q PCR檢測(cè)結(jié)果示,miR-200a的表達(dá)在NC-miRNA組與control組無(wú)明顯差別(P0.05);在agomir組miR-200a表達(dá)較NC-miRNA組明顯增多(P0.05),在antagomir組其表達(dá)較NC-miRNA組明顯減少(P0.05)。提示agomir上調(diào)miR-200a表達(dá),antagomir下調(diào)miR-200a表達(dá)。3.雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-200a與β-catenin的作用靶點(diǎn)雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染CTNNB1 UTR MT質(zhì)粒的各組間相對(duì)熒光活性比值無(wú)明顯差異(P0.05);轉(zhuǎn)染CTNNB1 UTR WT質(zhì)粒的各組,control組和NC-miRNA組無(wú)明顯差異,但在antagomir組熒光活性比值較NC-miRNA組明顯升高(P0.05),在agomir組熒光活性比值較NC-miRNA組明顯降低(P0.05)。提示miR-200a直接以β-catenin的基因CTNNB1為靶標(biāo)。4.上調(diào)miR-200a(agomir)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的β-catenin及小管EMT的影響細(xì)胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)在TGF-β1組和NC-miRNA+TGF-β1組之間無(wú)明顯差異(P0.05);在TGF-β1組,β-catenin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)較control組明顯增多(P0.05),E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)較control組明顯減少(P0.05);在agomir+TGF-β1組,β-catenin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)較NC-miRNA+TGF-β1組明顯下調(diào)(P0.05),同時(shí)較TGF-β1組明顯下調(diào)(P0.05),E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)則較NC-miRNA+TGF-β1組明顯上調(diào)(P0.05),同時(shí)較TGF-β1組明顯上調(diào)(P0.05)。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果與蛋白結(jié)果一致,即E-cadherin熒光在TGF-β1組較control組顯著減弱,在agomir+TGF-β1組則較NC-miRNA+TGF-β1組明顯增強(qiáng);α-SMA熒光在TGF-β1組較control組明顯增強(qiáng),在agomir+TGF-β1組則較NC-miRNA+TGF-β1組顯著減弱。提示上調(diào)miR-200a減弱TGF-β1誘導(dǎo)的β-catenin表達(dá),抑制小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化5.下調(diào)miR-200a(antagomir)對(duì)β-catenin及小管EMT的影響細(xì)胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)在control組與在NC-miRNA組無(wú)明顯差別(P0.05);在antagomir組,β-catenin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)較NC-miRNA組明顯升高(P0.05);E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)則較NC-miRNA組明顯降低(P0.05)。細(xì)胞免疫熒光顯示,在control組和NC-miRNA組,E-cadherin出現(xiàn)明顯紅色熒光,α-SMA則有少許微弱的熒光;在antagomir組E-cadherin熒光明顯減弱,α-SMA熒光顯著增強(qiáng)。提示下調(diào)miR-200a可增加β-catenin表達(dá),促進(jìn)小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。6.β-catenin siRNA對(duì)細(xì)胞β-catenin表達(dá)的影響在control組和NC-siRNA組β-catenin的mRNA表達(dá)無(wú)明顯差別(P0.05),但在si R-β-catenin組,β-catenin表達(dá)較NC-siRNA組明顯下調(diào)(P0.05);Western Blot結(jié)果與q PCR結(jié)果相符,即β-catenin表達(dá)在control組和NC-siRNA組正常表達(dá),但在si R-β-catenin組較NC-siRNA組表達(dá)顯著減少(P0.05)。提示β-catenin siRNA抑制β-catenin表達(dá)。7.干擾β-catenin對(duì)antagomir誘導(dǎo)的小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響細(xì)胞E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)在antagomir組與antagomir+NC-siRNA組無(wú)明顯差異(P0.05);在antagomir組,E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)較control組顯著減少(P0.05),α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)則較control組顯著增加;在antagomir+si R-β-catenin組,E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)較antagomir+NC-siRNA組表達(dá)上調(diào)(P0.05);α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)則較antagomir+NC-siRNA組表達(dá)下調(diào)(P0.05)。提示β-catenin siRNA抑制antagomir誘導(dǎo)的小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化,反證了miR-200a直接調(diào)控β-catenin影響腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化結(jié)論:1.在TGF-β1誘導(dǎo)小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中miR-200a表達(dá)下調(diào),而β-catenin表達(dá)上調(diào);2.miR-200a直接以β-catenin的基因CTNNB1為靶標(biāo);3.上調(diào)miR-200a減弱TGF-β1誘導(dǎo)的β-catenin表達(dá),抑制小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化;下調(diào)miR-200a可增加β-catenin表達(dá),促進(jìn)小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化;4.β-catenin siRNA抑制antagomir誘導(dǎo)的小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化,反證了miR-200a直接調(diào)控β-catenin影響腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化;由此得出,miR-200a通過(guò)直接以β-catenin為靶標(biāo)抑制TGF-β1誘導(dǎo)的小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。
【關(guān)鍵詞】：miR-200a β-catenin 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化 腎間質(zhì)纖維化
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R692
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• 英文摘要6-11
• 中文摘要11-15
• 前言15-17
• 材料與方法17-32
• 結(jié)果32-46
• 討論46-52
• 全文結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 文獻(xiàn)綜述 miRNA-200 家族與腎間質(zhì)纖維化57-63
• 參考文獻(xiàn)60-63
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文63-64
• 致謝64

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 麥玉潔,李云濤,邱錄貴;β-catenin與惡性腫瘤[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(內(nèi)科學(xué)分冊(cè));2005年05期

2 ;α-catenin expression is decreased in patients with gastric carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2005年22期

3 姜濤;劉慶華;陳峻青;;β-catenin與惡性腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2007年06期

4 林曉;李昱;米粲;;Expressions of beta-catenin, APC Protein, C-myc and Cyclin D1 in Ovarian Epithelial Tumor and Their Implication[J];Chinese Journal of Cancer Research;2007年02期

5 田黎明;謝紅付;楊婷;李吉;胡威;彭圓;;β-catenin在不同年齡人群非曝光部位皮膚組織中的表達(dá)及意義[J];中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志;2013年12期

6 王慧;張進(jìn)祥;馮瑋;張述;梁慧芳;汪洋;鄭啟昌;李卓婭;;PIN1 Gene Overexpression and β-catenin Gene Mutation/Expression in Hepatocellular Carcinoma and Their Significance[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2007年01期

7 林曉;胡琢瑛;;Expression of Wnt-1,beta-catenin and c-myc in Ovarian Epithelial Tumor and Its Implication[J];Chinese Journal of Cancer Research;2008年01期

8 王宛明;管淑敏;;α-catenin在食管鱗狀上皮細(xì)胞癌中表達(dá)的免疫組化研究[J];中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生;2008年19期

9 Mei-Fang Quan;Li-Hong Xiao;Zhi-Hong Liu;Hui Guo;Kai-Qun Ren;Fei Liu;Jian-Guo Cao;Xi-Yun Deng;;8-bromo-7-methoxychrysin inhibits properties of liver cancer stem cells via downregulation of β-catenin[J];World Journal of Gastroenterology;2013年43期

10 李媛,吳人亮,王曦,陳文書;Effects of Retinoic Acid on the β-catenin/TCF Pathway in Cultured Porcine Tracheobronchial Epithelial Cells[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)英德文版);2004年05期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 ;Regulatory roles of β-catenin on the proliferation of hair follicle stem cells[A];“細(xì)胞活動(dòng) 生命活力”——中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)全體會(huì)員代表大會(huì)暨第十二次學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2011年

2 ;WntSa inhibits the growth of hair follicles by antagonizing canonical Wnt/p-catenin signaling in mice in vivo[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十八次全國(guó)皮膚性病學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2012年

3 ;The Cytoplasmic Domain of MUC1 Induces Hyperplasia in the Mammary Gland and Correlates with Nuclear Accumulation of β-catenin[A];“細(xì)胞活動(dòng) 生命活力”——中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)全體會(huì)員代表大會(huì)暨第十二次學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2011年

4 Jing Du;Yan Zu;Jing Li;Xiao-fei Chen;Guang-yao Zhang;Chun Yang;;Wnt/p-catenin feedback loop plays an important role in mechano-sensation of ECM elasticity[A];第十屆全國(guó)生物力學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨第十二屆全國(guó)生物流變學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2012年

5 Chan Xie;Dong-ying Xie;Geng-lin Zhang;Pei-pei Wang;Liang Peng;Zhi-liang Gao;;FOXG1 promote HCC stem cell self-renewal through promoting b-catenin nuclear accumulating by forming TCF4/b-cateinin/FOXG1 complex[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十六次全國(guó)病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2013年

6 武海麗;李宗偉;楊鵬;李卓玉;;Knockdown of PKM2 induces the compensation of glutaminolysis through β-catenin-Myc pathway intumor cells[A];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)第十一次會(huì)員代表大會(huì)暨2014年全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集——大會(huì)報(bào)告及博士生論壇[C];2014年

7 武海麗;李宗偉;楊鵬;李卓玉;;Knockdown of PKM2 induces the compensation of glutaminolysis through β-catenin-Myc pathway in tumor cells[A];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)第十一次會(huì)員代表大會(huì)暨2014年全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集——專題報(bào)告二[C];2014年

8 岳曉;張志勇;楊e，

本文編號(hào)：564097