發(fā)布時(shí)間：2017-07-15 12:06

  本文關(guān)鍵詞：自噬通過減輕胰島素抵抗對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

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【摘要】：背景和目的糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是一種慢性腎臟疾病,最終可發(fā)展成為終末期腎臟疾病(end-stage renal disease, ESRD)引發(fā)腎臟功能衰竭。在疾病的早期階段DN患者便可以出現(xiàn)微量蛋白尿的臨床癥狀,這與病程早期腎小球?yàn)V過屏障受損密切相關(guān)。腎小囊臟層上皮細(xì)胞,即足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化是DN的早期病理特征。足細(xì)胞是胰島素直接作用的靶細(xì)胞,正常的足細(xì)胞胰島素信號(hào)通路對(duì)于腎小球功能和葡萄糖攝取的維持至關(guān)重要。自噬即“自我吞噬”,是一種進(jìn)化上高度保守的胞內(nèi)代謝過程,通過對(duì)胞內(nèi)聚集的蛋白和受損的細(xì)胞器進(jìn)行降解和循環(huán)再利用參與維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。研究表明,自噬缺陷可能涉及胰島素抵抗(insulin resistance, IR)和糖尿病的發(fā)病機(jī)理。目前在肝臟、骨骼肌和脂肪組織中均有自噬流影響胰島素信號(hào)通路的報(bào)道。但是自噬對(duì)不同組織細(xì)胞胰島素信號(hào)通路的影響各有利弊。在骨骼肌細(xì)胞中Atg5基因沉默或者藥物抑制細(xì)胞自噬的同時(shí)可以其降低胰島素敏感性。Atg5過表達(dá)的小鼠自噬活性增強(qiáng),出現(xiàn)抗衰老的表型,包括體型偏瘦,胰島素敏感性增強(qiáng)及運(yùn)動(dòng)功能的改善。而HCV感染誘發(fā)的自噬可能有促進(jìn)IR的發(fā)生。在脂肪細(xì)胞中自噬缺陷誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與胰島素信號(hào)抵抗密切相關(guān)。然而在糖尿病環(huán)境下自噬在足細(xì)胞功能及胰島素應(yīng)答方面的作用仍不清楚。本研究中,我們旨在探討高糖誘導(dǎo)的IR和人足細(xì)胞損傷及細(xì)胞自噬在該過程中的可能作用。方法1.人足細(xì)胞培養(yǎng)及處理：條件永生化人足細(xì)胞HPC在33℃的培養(yǎng)箱中(5%C02),培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清。培養(yǎng)基為：低糖培養(yǎng)基(5.5 mmol/L葡萄糖,LG)、高糖(30 mmol/L葡萄糖,HG)、高滲(30 mmol/L甘露醇,HO)。2.人足細(xì)胞葡萄糖攝取能力的評(píng)價(jià)采用2-NBDG攝取試驗(yàn),利用熒光強(qiáng)度的不同來檢測(cè)各組差異。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率。Western blot分析和免疫熒光染色檢測(cè)不同處理下胰島素受體p亞單位的磷酸化水。3.用免疫組化染色方法檢測(cè)非糖尿病患者和糖尿病腎病患者腎臟組織切片中胰島素受體磷酸化水平。4.通過、Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)nephrin及自噬相關(guān)標(biāo)志物如LC3B、 Beclin-1和p62/SQSTM1的表達(dá)水平。5.用自噬抑制劑3-MA (5 mM)和自噬激活劑Rapa (100 nM)調(diào)節(jié)自噬活性。改變自噬活性后用2-NBDG檢測(cè)葡萄糖攝取情況,用Western blot和免疫熒光檢測(cè)胰島素受體磷酸化水平,同時(shí)用Western blot檢測(cè)nephrin的表達(dá)情況。結(jié)果1.高糖環(huán)境下足細(xì)胞糖攝取減少,胰島素受體磷酸化水平降低。通過2-NBDG攝取試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與LG對(duì)照組及HO對(duì)照相比,HG (30 mM)刺激72 h后HPC細(xì)胞糖攝取能力降低(P0.05)。通過Western blot試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HG刺激72 h胰島素受體磷酸化水平降低(P0.05)。免疫熒光染色也表明HG刺激72 h后,磷酸化的胰島素受體(Phosphoryted insulin receptor, p-IR)水平明顯低于LG和HO對(duì)照組。此外,免疫組化實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),糖尿病腎病患者的腎臟切片中,在腎臟腎小囊臟層上皮細(xì)胞中IR的磷酸化水平明顯低于非DN患者。2.高糖環(huán)境下足細(xì)胞裂孔膜蛋白nephrin表達(dá)減少經(jīng)RT-qPCR研究發(fā)現(xiàn)：HPC細(xì)胞在HG刺激后72 h后,足細(xì)胞裂孔膜蛋白nephrin在mRNA水平表達(dá)顯著降低(P0.05)。通過、Vestern blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)論：HG組與LG組及HO組相比,nephrin的蛋白表達(dá)水平明顯降低(P0.05)。3.高糖環(huán)境下自噬的改變Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,高糖(HG 30mmol/L葡萄糖)與低糖(LG 5.5 mmol/L葡萄糖)及高糖與高滲組(HO 30mmol/L甘露糖)相比,刺激72h后,HPC細(xì)胞的LC3B II水平均降低,Beclin-1與對(duì)照組比較水平也明顯降低,p62水平升高(P0.05). RT-qPCR結(jié)果表明,高糖刺激72 h下的HPC細(xì)胞LC3B的mRNA水平明顯降低(P0.05),p62/SQSTM1的mRNA水平明顯升高(P0.05),而beclin-1的mRNA水平在HG刺激72 h下與LG及HO組相比均無(wú)顯著改變(P0.05)。4.足細(xì)胞自噬對(duì)其胰島素敏感性的調(diào)節(jié)Western blot結(jié)果表明,自噬抑制劑3-MA可以明顯降低自噬水平,具體表現(xiàn)為L(zhǎng)C3BII的降低及P62蛋白的累積(P0.05),而Rapa可以增加LC3BⅡ及Beclin-1的表達(dá)(P0.01)并減少P62蛋白累積(P0.05)。3-MA和Rapa對(duì)自噬活性的調(diào)節(jié)作用也在免疫熒光結(jié)果中得到了驗(yàn)證。此外結(jié)果表明,3-MA在降低自噬活性的同時(shí)可以降低葡萄糖的攝取水平(P0.01),減少IP的磷酸化。Rapa在激活自噬的同時(shí)增加2-NBDG攝取(P0.05),提高IR的磷酸化水平。免疫熒光試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步支持了這一結(jié)論。最后,我們發(fā)現(xiàn)3-MA在降低自噬活性的同時(shí)可以減少nephrin表達(dá)水平(P0.01),加劇高糖對(duì)足細(xì)胞裂孔膜蛋白nephrin的損傷,而Rapa則使nephrin表達(dá)水平增加,可以減輕高糖環(huán)境對(duì)足細(xì)胞的這種損傷(P0.01)。結(jié)論1.高糖暴露導(dǎo)致足細(xì)胞損傷,胰島素反應(yīng)受損。2.高糖下足細(xì)胞自噬活性下降。3.抑制自噬水平可以加劇高糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗,進(jìn)而加重足細(xì)胞損害。4.激活自噬可以一定程度上恢復(fù)胰島素敏感性,減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。
【關(guān)鍵詞】：胰島素抵抗 自噬 足細(xì)胞 糖尿病腎病
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 中英文縮略詞表13-15
• 前言15-19
• 材料與方法19-34
• 結(jié)果34-41
• 討論41-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-55
• 致謝55-57
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文57
• 攻讀碩±學(xué)位期間的榮V獎(jiǎng)勵(lì)57-58
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表58

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