本文關鍵詞：紅細胞表面分子在腎移植術后免疫功能狀態(tài)評價中的臨床價值，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腎移植手術發(fā)展至今,已經(jīng)使無數(shù)的終末期腎病患者的生存質(zhì)量得到顯著提高,生存時間得以延長,但腎移植術后排斥反應和感染會導致移植腎失功,甚至危及受者生命。目前學術界普遍認為,上述兩種亟需攻克的難題與機體免疫功能失衡息息相關。隨著免疫抑制治療手段的不斷進步,組織配型技術和外科手術技術的提高,移植排斥反應的發(fā)生率正在逐年降低。但是免疫抑制藥物的使用也提高了腎移植受者機會性感染的風險,可以說免疫抑制藥物的臨床應用具有雙面性,在保護移植器官免受宿主體內(nèi)免疫系統(tǒng)攻擊的同時也導致了機會性感染的發(fā)生。因此,移植術后如何對受者的免疫功能狀態(tài)做出客觀、準確的評價,是指導臨床免疫抑制藥物合理使用的基礎,這樣既可以使腎移植受者的免疫狀態(tài)在免疫排斥和免疫耐受之間保持平衡,確保移植物在受者體內(nèi)長期存活,又可以避免因免疫抑制劑過量應用帶來的潛在風險,因此腎移植術后受者體內(nèi)免疫功能的評價是當前器官移植領域關注的焦點之一。紅細胞(RBC)是血液運送氧氣的最主要的媒介,而近年來的研究發(fā)現(xiàn),紅細胞除了具有攜氧功能之外,還具有免疫功能,是人體內(nèi)數(shù)量最多的天然免疫細胞。既往的研究認為,成熟的無核紅細胞似乎不具備參與機體免疫功能的遺傳物質(zhì)基礎。直到1981年Siegel提出“紅細胞免疫系統(tǒng)”的概念,學術界才認識到紅細胞膜表面表達了許多免疫分子,這些免疫相關物質(zhì)參與了黏附、識別、濃縮、殺傷抗原、清除循環(huán)免疫復合物(circulating immune complex, CIC)等過程。對肺炎球菌和梅毒螺旋體等進行體外實驗中發(fā)現(xiàn),在有補體和紅細胞參與的情況下,白細胞的吞噬功能明顯增強；也有研究報道紅細胞可以阻止腫瘤細胞在體內(nèi)的擴散,這些研究均提示紅細胞雖然沒有細胞核,但是仍然具有免疫調(diào)節(jié)功能。紅細胞對于維持機體免疫系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定發(fā)揮著至關重要的作用,在體內(nèi)可以與淋巴細胞等免疫細胞相互作用,協(xié)同參與對免疫細胞網(wǎng)絡的調(diào)控。紅細胞參與對機體免疫反應的調(diào)控主要是通過其表達的膜表面免疫分子實現(xiàn)的,其中,補體受體-1(complement receptor 1, CR1/CD35)在紅細胞免疫黏附功能中具有非常重要的作用,其與C3b具有較強的親和力,可以結合并參與清除血漿中的循環(huán)物質(zhì),促進單核-巨噬細胞吞噬循環(huán)中的免疫復合物,并通過二次抗原遞呈的作用間接參與調(diào)控細胞因子的產(chǎn)生。紅細胞還可通過產(chǎn)生特異性TNF誘導因子、NK細胞增強因子等來參與機體非特異性免疫調(diào)控,及細胞因子的調(diào)控,盡管其分子機制尚未完全明確,但有研究證實紅細胞可以通過其膜表面CD58、CD59等淋巴細胞CD2的天然配體分子促進與NK細胞和T細胞的結合,清除淋巴細胞微環(huán)境活性氧物質(zhì),提高NK細胞殺傷活性和T細胞抗凋亡能力,并促進淋巴細胞產(chǎn)生IL-1、IL-2等細胞因子。已有多種疾病的病程進展中存在紅細胞膜表面分子表達異常,如肝炎、良惡性腫瘤、自身免疫性疾病、糖尿病等。慢性腎衰竭患者由于腎功能的損壞,促紅細胞生成素分泌減少,容易導致貧血的發(fā)生。腎移植手術后,隨著腎功能恢復,同時貧血狀況也隨之改善,但是在此過程中,紅細胞膜表面免疫分子的表達變化以及紅細胞免疫功能狀態(tài)等尚未有相關研究。鑒于此,本研究就紅細胞免疫分子在腎移植術后表達變化及其機制進行了分析探討。首先,通過流式細胞術測定腎移植受者紅細胞膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59的表達,旨在明確腎移植及其術后不同免疫狀態(tài)下受者紅細胞膜表面分子表達變化情況,從而更全面的評估腎移植受者的免疫狀態(tài),以期為臨床免疫抑制治療提供更好的依據(jù)。并利用Transwell和細胞聯(lián)合培養(yǎng)等方法,觀察體外條件下,不同免疫抑制劑對紅細胞免疫分子表達的影響,以及紅細胞與T、B淋巴細胞的相互作用,通過對培養(yǎng)過程中細胞因子表達情況的檢測,對不同免疫狀態(tài)的腎移植受者紅細胞對T和B淋巴細胞增殖情況的影響機制進行研究,觀察紅細胞免疫功能腎移植術后不同免疫狀態(tài)下的變化,以及紅細胞在體外對淋巴細胞調(diào)節(jié)作用的機制。一、紅細胞CD35/CD58/CD59在腎移植受者中的表達變化選擇2013年1月至2014年6月間接受首次同種異體腎移植手術,術后移植腎功能穩(wěn)定的受者50例為穩(wěn)定組,慢性腎衰竭患者65例為慢性排斥反應慢性腎衰竭組(簡稱CRF組),以50例健康體檢人員為對照組。同時,對52例腎移植受者進行組織病理學檢查,選擇腎移植術后發(fā)生移植腎功能延遲恢復的受者11例為移植腎功能延遲恢復組(簡稱DGF組),以及腎移植術后發(fā)生急性排斥反應的受者16例為急性排斥反應組(簡稱AR組),留取上述不良事件發(fā)生時的腎移植受者外周抗凝血樣本。采用流式細胞術分別檢測各組研究對象的外周血紅細胞膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59的平均幾何熒光強度(GMFI)表達,觀察腎移植受者術后發(fā)生腎功能延遲恢復和排斥反應時外周血紅細胞免疫分子CD35/CD58/CD59的變化,并與對照組和穩(wěn)定組進行比較,來探討紅細胞免疫功能在受者腎移植后不同狀態(tài)的表達情況。結果顯示,CRF組CD35、CD58、CD59的GMFI表達分別為(25.26±7.92)、(89.94±13.8)、(75.38±16.49)明顯低于對照組,P0.05；穩(wěn)定組CD35 (27.04 ±6.0)、CD59(87.62±20.90)的表達雖然較CRF組高,但明顯低于對照組,P0.05,穩(wěn)定組CD59的表達明顯高于CRF組,P0.05；穩(wěn)定組CD58的表達與對照組無明顯差異,P0.05。DGF組與AR組紅細胞免疫分子CD35表達分別為(22.46±5.01)、(24.51±6.58),明顯低于對照組,P0.05,但與穩(wěn)定期對照組差異無統(tǒng)計學意義；DGF組和AR組CD58表達分別為(73.24±11.11)、(77.42±16.60)明顯低于對照組,P0.05; DGF組和AR組紅細胞免疫分子CD59表達分別為(58.66±15.82)、(77.17±28.49),明顯低于對照組,P0.05 AR組雖低于穩(wěn)定組,但無統(tǒng)計學意義；DGF組CD59表達明顯低于AR組,P0.05。該結果提示,由于腎功能受損,CRF患者紅細胞表達的免疫分子均有所下調(diào),紅細胞免疫功能受損,而腎移植術后隨著腎功能恢復,紅細胞表達的免疫分子有所恢復,但除CD58表達與正常對照無差別之外,CD35和CD59表達仍低于正常對照。在腎移植術后出現(xiàn)DGF時,體內(nèi)出現(xiàn)過度的缺血再灌注損傷,對紅細胞免疫分子表達影響明顯,尤其是CD58和CD59,其表達低于穩(wěn)定組和對照組,并且CD59甚至低于AR組,提示缺血再灌注損傷產(chǎn)生的大量活性氧自由基對紅細胞表達免疫膜分子影響明顯。而AR時,由于炎癥的局限性,未能形成全身性的炎癥反應,因此其表達變化較小。二、腎移植受者紅細胞免疫功能與淋巴細胞亞群相關性及巨細胞病毒感染對紅細胞CD35/CD58/CD59表達的影響對2013年1月至2014年6月間接受首次同種異體腎移植手術的受者術后血清肌酐恢復情況進行監(jiān)測,選擇30例腎移植術后功能穩(wěn)定的受者為連續(xù)監(jiān)測組,分別于術前1d、術后3d、7d、14d各個時間點采集連續(xù)監(jiān)測組受者外周血樣本；收集臨床疑似病毒感染的腎移植受者外周血進行間接免疫熒光技術對其巨細胞病毒(CMV)早期抗原PP65檢測,以發(fā)現(xiàn)1個或1個以上陽性細胞/2×105個白細胞,則定為陽性。選擇外周血CMV-pp65抗原陽性的腎移植受者61例為CMV活動性感染組(簡稱CMV組),采用流式細胞術同時檢測其外周血紅細胞免疫分子CD35/CD58/CD59的表達和T、B、NK淋巴細胞的水平。研究發(fā)現(xiàn),健康對照組紅細胞CD35的表達與CD59表達呈正相關,與CD4+T細胞的百分比呈正相關,與B細胞的百分比呈負相關,差異均有統(tǒng)計學意義。腎移植受者術前1d、術后3d、7d、14d的紅細胞免疫分子CD35GMFI表達分別為(27.00±7.5)、(28.04±7.2)、(25.70±6.83)和(24.19±6.0)均低于對照組,P0.05。受者術前、術后3d、7d、14d的紅細胞免疫分子CD59GMFI表達分別為(80.44±20.56)、(91.50±23.17)、(85.02±24.92)和(82.67±25.56)均低于對照組,P0.05。受者紅細胞免疫分子CD58GMFI表達與對照組比較,差異沒有統(tǒng)計學意義。連續(xù)監(jiān)測組術后3dCD3+T淋巴細胞絕對數(shù)(773.5±301)低于對照組,P0.05；術后3d與術前1d(2288±723)相比明顯降低,P0.05； NK細胞絕對數(shù)在術后3d時降至最低(108.3±40.1),與對照組、術前1d、術后14d比較P0.05；B細胞絕對數(shù)在術后7d(610.2±215.6)、14d(765.5±269.4)急劇增高,甚至高于術前和對照組,P0.05。CMV組的紅細胞免疫分子CD35/CD58/CD59表達明顯低于對照組,P0.05；非活動性感染組的CD59表達高于CMV組,P0.05。其中高活動性感染組的紅細胞CD35、CD59的表達均低于低活動感染組,P0.05。三、紅細胞對T、B淋巴細胞影響的初步探討對2015年7月至2015年12月期間接受同種異體腎移植術后3個月內(nèi)穩(wěn)定期的受者,以及在B超引導下移植腎穿刺活檢后病理結果提示發(fā)生排斥反應的受者,留取其外周抗凝血標本,用密度梯度離心法分離紅細胞和單個核細胞(PBMC).分離后的紅細胞加免疫抑制劑刺激48h與單獨培養(yǎng)48h的膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59表達相比沒有明顯差異。將穩(wěn)定期受者紅細胞、排斥受者紅細胞分別與健康人的PBMC聯(lián)合培養(yǎng)后,采用流式細胞術對培養(yǎng)后的混合細胞中紅細胞膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59的表達和T、B淋巴細胞的水平進行檢測,發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定紅細胞組B細胞比例較排斥組明顯增高,并且CD19表達的明顯上調(diào),出現(xiàn)強陽性細胞群。通過用流式細胞術對該群細胞表型分析以及胞內(nèi)標記IL-10,結果顯示該細胞為分泌IL-10的CD19+的調(diào)節(jié)性B細胞亞群,提示穩(wěn)定期受者紅細胞可以增加外周血Breg細胞比例。為了明確紅細胞與誘導Breg之間的關系,我們利用磁珠分選純化B細胞和T細胞,發(fā)現(xiàn)單獨與紅細胞共培養(yǎng)的B細胞沒有明顯增殖,而加入T細胞共培養(yǎng)則Breg亞群增加,提示紅細胞是通過T細胞誘導Breg產(chǎn)生和B細胞增殖的。為了對細胞之間相互調(diào)控的機制進行深入研究,我們利用Transwell小室,將紅細胞與T細胞聯(lián)合至于小室上層進行培養(yǎng),同時在下室加入B細胞,結果發(fā)現(xiàn)B細胞出現(xiàn)增殖,Breg亞群比例增加,提示T細胞可能通過旁分泌的方式誘導Breg的產(chǎn)生；ELISA檢測結果顯示,穩(wěn)定紅細胞組和T細胞共培養(yǎng)后培養(yǎng)上清中的IL-10和TGF-β的含量高于排斥紅細胞組。體外聯(lián)合培養(yǎng)的結果提示,紅細胞可以通過促進T細胞分泌IL-10和TGF-β來誘導B細胞增殖和Breg的產(chǎn)生。結論：慢性腎衰竭患者體內(nèi)紅細胞膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59表達降低,提示在慢性腎功能衰竭的尿毒癥狀態(tài)損害了紅細胞免疫功能,移植后,腎功能隨著肌酐的降低逐漸恢復,紅細胞膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59表達有所上調(diào),但除了CD58之外,CD35和CD59表達在腎功能恢復后其表達仍低于健康對照組,可能與免疫抑制劑的使用有關。腎移植手術后,紅細胞免疫功能和淋巴細胞免疫功能均出現(xiàn)紊亂,在術后隨著血清肌酐的降低、腎功能穩(wěn)定后可逐漸恢復。腎移植術后發(fā)生DGF、急性排斥反應和巨細胞病毒感染時,受者紅細胞膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59表達下調(diào),提示這些不良事件過程伴隨有紅細胞免疫功能的變化,與疾病過程有關。免疫抑制劑西羅莫司、環(huán)孢素和他克莫司在短時間內(nèi)并不影響循環(huán)中紅細胞表面CD35/CD58/CD59分子的表達。穩(wěn)定期受者紅細胞可促進健康對照者PBMC中的B細胞增殖,且可誘導B細胞向調(diào)節(jié)性B細胞亞群分化,該過程是是通過促進T細胞活化分泌細胞因子來間接誘導B細胞增殖的。采用流式細胞術對紅細胞膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59的表達進行檢測,對于評估腎移植受者術后免疫狀態(tài),早期診斷、預防排斥反應、感染等不良反應的發(fā)生,以及指導合理用藥有一定臨床意義。
【關鍵詞】：腎移植 紅細胞 T細胞 B細胞 巨細胞病毒
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R699.2
【目錄】：

• 縮略詞表5-8
• 中文摘要8-13
• Abstract13-18
• 前言18-21
• 一、紅細胞CD35/CD58/CD59在腎移植受者中的表達變化21-37
• 1 實驗材料21-22
• 2 實驗方法22-28
• 3 結果28-34
• 4 討論34-37
• 二、腎移植受者紅細胞免疫功能與淋巴細胞亞群相關性及巨細胞病毒感染對紅細胞CD35/CD58/CD59表達的影響37-59
• （一）腎移植受者紅細胞CD35/CD58/CD59與T、B淋巴細胞亞群的變化37-52
• 1 實驗材料37-38
• 2 實驗方法38-40
• 3 結果40-50
• 4 討論50-52
• （二）腎移植受者巨細胞病毒感染時紅細胞CD35/CD58/CD59表達的變化52-59
• 1 實驗材料52-53
• 2 實驗方法53-55
• 3 結果55-57
• 4 討論57-59
• 三、紅細胞對T、B淋巴細胞影響的初步探討59-73
• 1 實驗材料59-60
• 2 實驗方法60-65
• 3 結果65-69
• 4 討論69-73
• 結論73-74
• 參考文獻74-81
• 文獻綜述81-88
• 參考文獻85-88
• 發(fā)表論著（一）88-97
• 發(fā)表論著（二）97-104
• 個人簡歷104-105
• 致謝105

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本文編號：502839