本文關(guān)鍵詞：HIF-1α在男性不育癥發(fā)生機(jī)制中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 隨著社會(huì)發(fā)展，不孕不育癥的發(fā)生率越來(lái)越高。據(jù)中國(guó)人口協(xié)會(huì)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)不孕不育癥患者已超過(guò)4000萬(wàn)，占育齡人口（25-30歲）的12.5%，平均每8對(duì)夫妻中就有1對(duì)不孕不育癥患者。由男性因素引起的不育癥比例達(dá)到了50%，且有逐年上升趨勢(shì)。男性不育病因復(fù)雜，除了生殖系統(tǒng)病變外，雙酚A，，重金屬，吸煙等環(huán)境毒物及糖尿病等疾病均可能造成睪丸生精功能的損傷，降低精子數(shù)量和質(zhì)量，導(dǎo)致男性不育，性功能障礙及流產(chǎn)、胎兒畸形等，嚴(yán)重?fù)p害了家庭的和諧和人口的質(zhì)量和數(shù)量。 睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig cell）又被人們叫做睪丸間隙細(xì)胞。其主要功能是分泌與合成雄激素(包括孕烯醇酮、睪酮等)，刺激雄性內(nèi)外生殖器的發(fā)育成熟。如果Leydig cell功能障礙，將會(huì)導(dǎo)致男性原發(fā)性性腺功能低下，引起男性不育癥。由于氧化應(yīng)激（OS）是多種物理化學(xué)、生物因素等共同損傷男性生殖能力的方式。因此探尋OS引起生殖細(xì)胞的不同程度的損傷、尋找有效控制生殖細(xì)胞氧化應(yīng)激的方法將是男性不育治療最有前途的策略之一。HIF-1α作為細(xì)胞組織在適應(yīng)低氧環(huán)境的重要調(diào)節(jié)因子，深入探尋其在睪丸間質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激中的調(diào)控機(jī)制將會(huì)對(duì)治療男性不育方面提供一定的理論基礎(chǔ)。 目的 了解HIF-1α在男性不育癥發(fā)生中的作用，針對(duì)作用機(jī)理探討治療男性不育癥的治療方法。 方法 （1）小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3細(xì)胞的培養(yǎng)，分為五部分處理： 第一部分是使用50μg/ml AGES；另外一組僅使用完全培養(yǎng)基，兩組都培養(yǎng)48h。處理好的細(xì)胞進(jìn)行以下（2）、（3）、（4）步驟操作。 第二部分是先通過(guò)使用干擾HIF-1α轉(zhuǎn)染，24h之后加入50μg/ml AGES培養(yǎng)24h；另外一組僅僅是轉(zhuǎn)染的陰性干擾質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)24h之后，給予50μg/ml AGES，再培養(yǎng)24h。處理好的細(xì)胞進(jìn)行以下（2）、（3）、（4）步驟檢測(cè)操作。 第三部分是在預(yù)先給與500μm DMOG24h后給予50μg/ml AGES培養(yǎng)48小時(shí)；對(duì)照預(yù)先給予0.1‰DMSO24h后給予50μg/ml AGES培養(yǎng)48小時(shí)。處理好的細(xì)胞進(jìn)行以下（2）、（3）、（4）步驟操作。 第四部分是給予干擾HIF-1α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并且培養(yǎng)48h；另外一組僅僅是轉(zhuǎn)染的陰性干擾質(zhì)粒培養(yǎng)48h之后。處理好的細(xì)胞進(jìn)行以下（2）、（3）、（4）步驟檢測(cè)操作。 第五部分是在預(yù)先給與500μm DMOG培養(yǎng)48h；對(duì)照預(yù)先給予0.1‰DMSO后培養(yǎng)48h。處理好的細(xì)胞進(jìn)行以下（2）、（3）、（4）步驟檢測(cè)操作。 （2）應(yīng)用western-blotting檢測(cè)各組細(xì)胞HIF-1α， Caspase3，HO-1，sTAR和CYP17A1的表達(dá)。 （3）應(yīng)用流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 （4）檢測(cè)各組細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的濃度。 結(jié)果 1.各組細(xì)胞的ROS濃度 1.1AGES組實(shí)驗(yàn)組ROS含量為（11.01±0.39），對(duì)照組ROS含量為（9.73±0.25)，實(shí)驗(yàn)組ROS含量顯著高于對(duì)照組，（P=0.0189）。表明小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞給予AGES處理48h后ROS含量增加。 1.2HIFsiRNA+AGES組實(shí)驗(yàn)組的ROS含量（9.38±1.25）顯著高于對(duì)照組（6.931±0.532），（P=0.0354），表明經(jīng)HIFsiRNA并給予后50μg/ml AGES后小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞ROS含量增加。 1.3HIFsiRNA組實(shí)驗(yàn)組ROS含量（15.03±0.3861）與對(duì)照組(9.733±0.2471)比較有顯著性升高，（P=0.0003），表明HIF能增加TM3細(xì)胞中的ROS含量。 1.4DMOG+AGES組實(shí)驗(yàn)組ROS含量(5.513±0.402)顯著低于對(duì)照組(10.014±0.694)（,P=0.0006）。表明給予500nmol/ml DMOG24h后再給予50μg/mlAGES培養(yǎng)48小時(shí)后，TM3細(xì)胞ROS含量降低。 1.5DMOG組實(shí)驗(yàn)組ROS含量(5.445±1.993)顯著低于對(duì)照組（9.733±0.2471），兩者比較差異不顯著，（P=0.0996）。表明兩組細(xì)胞變化不大。 2.各組細(xì)胞的凋亡率 2.1AGES組早期凋亡率實(shí)驗(yàn)組為（7.440±0.54）%，顯著高于AGES組對(duì)照組(1.370±0.0600)%，（P=0.0079），AGES組晚期凋亡率實(shí)驗(yàn)組為（18.79±1.09）%，顯著高于對(duì)照組（10.42±0.48）%，（P=0.0197）。AGES組總凋亡率實(shí)驗(yàn)組為（28.68±0.82）%，顯著高于對(duì)照組（11.84±0.465）%，（P=0.0031）。 2.2DMOG組實(shí)驗(yàn)組早期凋亡率為（0.745±0.035）%顯著低于DMOG組對(duì)照組(1.370±0.06)%，（P0.001）；DMOG組實(shí)驗(yàn)組晚期凋亡率為（9.45±0.45）%與DMOG組對(duì)照組(10.42±0.48)%比較差異不顯著，（P=0.2783）；DMOG組實(shí)驗(yàn)組總凋亡率為（9.845±0.835）%與DMOG組對(duì)照組(11.84±0.465)%相比差異不顯著，（P=0.1728）。 2.3DMOG+AGEs組實(shí)驗(yàn)組早期凋亡率為（1.547±0.029）%比DMOG+AGEs組對(duì)照組（1.267±0.081）%顯著升高，（P=0.0314）；DMOG+AGEs組實(shí)驗(yàn)組晚期凋亡率為（11.36±0.44）%比其對(duì)照組（17.37±0.59）%顯著降低，（P=0.0012）；DMOG+AGEs組實(shí)驗(yàn)組總凋亡率（12.91±0.415）%與其對(duì)照組（18.64+0.669）%也顯著降低，（P=0.0019）。 2.4HIFsiRNA組實(shí)驗(yàn)組的早期凋亡率為（1.25±0.06）%與其對(duì)照組(0.745±0.035)%相比較沒有太大的變化，（P=0.2929）；HIFsiRNA組實(shí)驗(yàn)組晚期凋亡率為（3.75±0.15）%顯著低于其對(duì)照組(10.42±0.48)%，（P=0.0056）；HIFsiRNA組實(shí)驗(yàn)組總凋亡率為（4.595±0.495）%顯著低于其對(duì)照組(11.84±0.465)%有，（P=0.0087）。 2.5HIFsiRNA+AGES組實(shí)驗(yàn)組的早期凋亡率為（5.84±0.5）%顯著低于其對(duì)照組(8.155±0.175)%，（P=0.0486）。HIFsiRNA+AGES組實(shí)驗(yàn)組的晚期凋亡率（11.02±0.30）%顯著低于其對(duì)照組（2）(18.55±1.335)%，（P=0.0316）。HIFsiRNA+AGES組實(shí)驗(yàn)組的總凋亡率（16.86±0.19）%顯著低于其對(duì)照組(26.7±1.16)%，（P=0.014）。 3.各組細(xì)胞的蛋白表達(dá) 3.1HIF-1α蛋白的表達(dá) HIF-1α蛋白表達(dá)在AGES組實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的HIF蛋白的相對(duì)表達(dá)量(0.1999±0.02627)比其對(duì)照組（1）(0.3487±0.01257)有顯著性降低，（P=0.0069）。在DMOG組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.4367±0.01449)比其對(duì)照組（5）(0.3487±0.01257)顯著性升高， P=0.0101。HIF-1α蛋白表達(dá)在HIF-1α siRNA組中，實(shí)驗(yàn)組被成功降低了表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率約70%，敲低表達(dá)約45%。在DMOG+AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.2548±0.01085)比其對(duì)照組(0.1999±0.02627)無(wú)顯著差異，P=0.1253。在HIF-1α siRNA+AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.2011±0.01438)比對(duì)照組(0.1999±0.02627)無(wú)顯著差異， P=0.9697。 3.2Caspase3蛋白的表達(dá) Caspase3蛋白在AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.3410±0.0131)與其對(duì)照組(0.4297±0.0293)比較無(wú)顯著性差異，（P=0.0503）。在DMOG組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.4758±0.0269)與其對(duì)照組(0.4297±0.0293)比較無(wú)顯著性差異， P=0.3109。在HIF-1α siRNA組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.3003±0.02016)比其對(duì)照組(0.6539±0.04475)顯著性降低， P=0.0020。在DMOG+AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.4772±0.0492)與其對(duì)照組(0.5525±0.03144)比較無(wú)顯著性差異，P=0.2665。在HIFsiRNA+AGES組實(shí)驗(yàn)組中的相對(duì)表達(dá)量(0.2855±0.022)低于其對(duì)照組(0.341±0.13)，P=0.0948。 3.3HO-1蛋白的表達(dá) HO-1蛋白在AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.2265±0.01211)比其對(duì)照組(0.3852±0.02199)有顯著性降低，（P=0.0032）。在DMOG組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.4223±0.008370)與其對(duì)照組(0.3852±0.02199))相比較沒有顯著性差異，P=0.1907。在HIF-1α siRNA組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.3418±0.02062)與其對(duì)照組(0.3852±0.02199)相比較沒有顯著性差異， P=0.2231。在DMOG+AGES組實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的HO-1基因蛋白的相對(duì)表達(dá)量(0.4638±0.05544)與其對(duì)照組(0.2265±0.01211)相比顯著性升高，P=0.0139。在HIFsiRNA+AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.3086±0.0154)與其對(duì)照組(0.2265±0.01211)相比顯著性升高，P=0.0138。 3.4CYP17A1蛋白的表達(dá) CYP17A1蛋白在AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.7441±0.03956)與其對(duì)照組(0.7462±0.02578)比較無(wú)顯著性差異，（P=0.9664）。在DMOG組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.8273±0。02107)與其對(duì)照組(0.7462±0.02578)比較無(wú)顯著性差異，P=0.0715。在HIF-1α siRNA組實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量(0.5158±0.01579)比其對(duì)照組(0.7462±0.02578)顯著性降低， P=0.0016。在DMOG+AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.7164±0.02530)與其對(duì)照組(0.7441±0.03956)比較無(wú)顯著性差異，P=0.5864。在HIFsiRNA+AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.3547±0.02325)比其對(duì)照組(0.7441±0.03956)有顯著性降低， P=0.0011。 3.5StAR蛋白的表達(dá) StAR蛋白在AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.6734±0.04594)與是對(duì)照組(0.7984±0.03910)相比沒有顯著性差異，（P=0.1069）。在DMOG組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.7951±0.04411)與是對(duì)照組（5）(0.7984±0.03910))相比較沒有顯著性差異， P=0.9578。在HIFsiRNA組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.6420±0.05320)與其對(duì)照組(0.7984±0.03910)相比較沒有顯著性差異， P=0.0769。在DMOG+AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.6291±0.05480)與其對(duì)照組(0.6734±0.04594)相比沒有有顯著性差異，P=0.3437。在HIFsiRNA+AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.4163±0.02377)比其對(duì)照組(0.6734±0.04594)顯著性降低， P=0.010。 結(jié)論 （1）HIF-1α可降低ROS的產(chǎn)生，在氧化應(yīng)激引起的男性不育中發(fā)揮了調(diào)控作用； （2）AGES引起的氧化應(yīng)激損傷不影響TM3細(xì)胞中的CYP17A1（P45017α1）和StAR基因的表達(dá)，但是可以介導(dǎo)HIF-1α對(duì)CYP17A1和StAR基因表達(dá)的調(diào)控； （3）AGEs可以導(dǎo)致HO-1顯著下降，并介導(dǎo)HIF-1α對(duì)HO-1的調(diào)控。 （4）HIF-1α促進(jìn)Caspase3的表達(dá)升高，從而引起TM3的凋亡。 （5）HIF-1α在氧化應(yīng)激損傷中的對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的調(diào)控作用為男性不育癥的診治提供了思路。
【關(guān)鍵詞】：男性不育癥 睪丸間質(zhì)細(xì)胞 低氧誘導(dǎo)因子（HIF） 氧化應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R698.2
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• Abstract9-16
• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照16-18
• 第1章 前言18-24
• 1.1 研究背景18
• 1.2 睪丸間質(zhì)細(xì)胞(TM3) 與氧化應(yīng)激18-19
• 1.3 HIF-1α的結(jié)構(gòu)及其功能19-20
• 1.4 HIF 在細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用20-22
• 1.4.1 HIF-1α與細(xì)胞凋亡20
• 1.4.2 HIF-1α和氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)20-21
• 1.4.3 HIF-1α與糖基化終末產(chǎn)物21-22
• 1.4.4 HIF-1α與脯氨酸羥化酶22
• 1.5 選題依據(jù)22-24
• 第2章 材料與方法24-33
• 2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象24
• 2.1.1 細(xì)胞株24
• 2.1.2 細(xì)胞冷凍復(fù)蘇24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑24-27
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器24-25
• 2.2.2 主要試劑25-26
• 2.2.3 主要試劑的配制26-27
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法27-32
• 2.3.1 實(shí)驗(yàn)分組27-28
• 2.3.2 細(xì)胞處理28-29
• 2.3.3 靶向 HIF-1α的 shRNA 干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建29
• 2.3.4 篩選干擾效率最佳的 siRNA 片段29-30
• 2.3.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)30
• 2.3.7 Western blotting 檢測(cè):30-32
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析32-33
• 第3章 結(jié)果33-54
• 3.1 HIF 在氧化應(yīng)激中對(duì) TM3 細(xì)胞 ROS 含量的影響33-35
• 3.1.1 AGES 組 TM3 細(xì)胞 ROS 含量變化33
• 3.1.2 HIFsiRNA+ AGES 組 TM3 細(xì)胞 ROS 含量變化33
• 3.1.3 HIFsiRNA 組 TM3 細(xì)胞 ROS 含量變化33
• 3.1.4 DMOG+ AGES 組 TM3 細(xì)胞 ROS 含量變化33-34
• 3.1.5 DMOG 組 TM3 細(xì)胞 ROS 含量變化34-35
• 3.2 HIF 在氧化刺激中對(duì) TM3 細(xì)胞凋亡的影響35-41
• 3.2.1 AGES 組 TM3 細(xì)胞的凋亡35-37
• 3.2.2 DMOG 組 TM3 細(xì)胞的凋亡37-38
• 3.2.3 DMOG+AGEs 組 TM3 細(xì)胞凋亡率的影響38-39
• 3.2.4 HIFsiRNA 組 TM3 細(xì)胞的凋亡39-40
• 3.2.5 HIFsiRNA+ AGES 組 TM3 細(xì)胞的凋亡40-41
• 3.3 HIF 調(diào)控 TM3 細(xì)胞氧化應(yīng)激蛋白表達(dá)的變化41-54
• 3.3.1 HIF-1α蛋白表達(dá)41-44
• 3.3.2 HIF-1α對(duì) TM3 細(xì)胞 Caspase 3 蛋白的調(diào)控44-46
• 3.3.3 HIF-1α對(duì) TM3 細(xì)胞 HO-1 蛋白的調(diào)控46-48
• 3.3.4 HIF-1α對(duì) TM3 細(xì)胞 CYP17A1 蛋白的調(diào)控48-51
• 3.3.5 HIF-1α對(duì) TM3 細(xì)胞 StAR 蛋白的調(diào)控51-54
• 第4章 討論54-57
• 第5章 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間所取得的科研成果63-64
• 致謝64

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 戚亞偉;胡傳銀;陳紹紅;趙云濤;劉鈾;;非酶糖基化終末產(chǎn)物抑制大鼠睪丸Leydig細(xì)胞睪酮的生成[J];中華男科學(xué)雜志;2014年05期

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  本文關(guān)鍵詞：HIF-1α在男性不育癥發(fā)生機(jī)制中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：475548