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HIF-1α在男性不育癥發(fā)生機(jī)制中的作用研究

發(fā)布時(shí)間:2017-06-23 16:04

  本文關(guān)鍵詞:HIF-1α在男性不育癥發(fā)生機(jī)制中的作用研究,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。


【摘要】:研究背景 隨著社會(huì)發(fā)展,不孕不育癥的發(fā)生率越來(lái)越高。據(jù)中國(guó)人口協(xié)會(huì)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,我國(guó)不孕不育癥患者已超過(guò)4000萬(wàn),占育齡人口(25-30歲)的12.5%,平均每8對(duì)夫妻中就有1對(duì)不孕不育癥患者。由男性因素引起的不育癥比例達(dá)到了50%,且有逐年上升趨勢(shì)。男性不育病因復(fù)雜,除了生殖系統(tǒng)病變外,雙酚A,,重金屬,吸煙等環(huán)境毒物及糖尿病等疾病均可能造成睪丸生精功能的損傷,降低精子數(shù)量和質(zhì)量,導(dǎo)致男性不育,性功能障礙及流產(chǎn)、胎兒畸形等,嚴(yán)重?fù)p害了家庭的和諧和人口的質(zhì)量和數(shù)量。 睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cell)又被人們叫做睪丸間隙細(xì)胞。其主要功能是分泌與合成雄激素(包括孕烯醇酮、睪酮等),刺激雄性內(nèi)外生殖器的發(fā)育成熟。如果Leydig cell功能障礙,將會(huì)導(dǎo)致男性原發(fā)性性腺功能低下,引起男性不育癥。由于氧化應(yīng)激(OS)是多種物理化學(xué)、生物因素等共同損傷男性生殖能力的方式。因此探尋OS引起生殖細(xì)胞的不同程度的損傷、尋找有效控制生殖細(xì)胞氧化應(yīng)激的方法將是男性不育治療最有前途的策略之一。HIF-1α作為細(xì)胞組織在適應(yīng)低氧環(huán)境的重要調(diào)節(jié)因子,深入探尋其在睪丸間質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激中的調(diào)控機(jī)制將會(huì)對(duì)治療男性不育方面提供一定的理論基礎(chǔ)。 目的 了解HIF-1α在男性不育癥發(fā)生中的作用,針對(duì)作用機(jī)理探討治療男性不育癥的治療方法。 方法 (1)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3細(xì)胞的培養(yǎng),分為五部分處理: 第一部分是使用50μg/ml AGES;另外一組僅使用完全培養(yǎng)基,兩組都培養(yǎng)48h。處理好的細(xì)胞進(jìn)行以下(2)、(3)、(4)步驟操作。 第二部分是先通過(guò)使用干擾HIF-1α轉(zhuǎn)染,24h之后加入50μg/ml AGES培養(yǎng)24h;另外一組僅僅是轉(zhuǎn)染的陰性干擾質(zhì)粒,經(jīng)過(guò)24h之后,給予50μg/ml AGES,再培養(yǎng)24h。處理好的細(xì)胞進(jìn)行以下(2)、(3)、(4)步驟檢測(cè)操作。 第三部分是在預(yù)先給與500μm DMOG24h后給予50μg/ml AGES培養(yǎng)48小時(shí);對(duì)照預(yù)先給予0.1‰DMSO24h后給予50μg/ml AGES培養(yǎng)48小時(shí)。處理好的細(xì)胞進(jìn)行以下(2)、(3)、(4)步驟操作。 第四部分是給予干擾HIF-1α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并且培養(yǎng)48h;另外一組僅僅是轉(zhuǎn)染的陰性干擾質(zhì)粒培養(yǎng)48h之后。處理好的細(xì)胞進(jìn)行以下(2)、(3)、(4)步驟檢測(cè)操作。 第五部分是在預(yù)先給與500μm DMOG培養(yǎng)48h;對(duì)照預(yù)先給予0.1‰DMSO后培養(yǎng)48h。處理好的細(xì)胞進(jìn)行以下(2)、(3)、(4)步驟檢測(cè)操作。 (2)應(yīng)用western-blotting檢測(cè)各組細(xì)胞HIF-1α, Caspase3,HO-1,sTAR和CYP17A1的表達(dá)。 (3)應(yīng)用流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 (4)檢測(cè)各組細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的濃度。 結(jié)果 1.各組細(xì)胞的ROS濃度 1.1AGES組實(shí)驗(yàn)組ROS含量為(11.01±0.39),對(duì)照組ROS含量為(9.73±0.25),實(shí)驗(yàn)組ROS含量顯著高于對(duì)照組,(P=0.0189)。表明小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞給予AGES處理48h后ROS含量增加。 1.2HIFsiRNA+AGES組實(shí)驗(yàn)組的ROS含量(9.38±1.25)顯著高于對(duì)照組(6.931±0.532),(P=0.0354),表明經(jīng)HIFsiRNA并給予后50μg/ml AGES后小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞ROS含量增加。 1.3HIFsiRNA組實(shí)驗(yàn)組ROS含量(15.03±0.3861)與對(duì)照組(9.733±0.2471)比較有顯著性升高,(P=0.0003),表明HIF能增加TM3細(xì)胞中的ROS含量。 1.4DMOG+AGES組實(shí)驗(yàn)組ROS含量(5.513±0.402)顯著低于對(duì)照組(10.014±0.694)(,P=0.0006)。表明給予500nmol/ml DMOG24h后再給予50μg/mlAGES培養(yǎng)48小時(shí)后,TM3細(xì)胞ROS含量降低。 1.5DMOG組實(shí)驗(yàn)組ROS含量(5.445±1.993)顯著低于對(duì)照組(9.733±0.2471),兩者比較差異不顯著,(P=0.0996)。表明兩組細(xì)胞變化不大。 2.各組細(xì)胞的凋亡率 2.1AGES組早期凋亡率實(shí)驗(yàn)組為(7.440±0.54)%,顯著高于AGES組對(duì)照組(1.370±0.0600)%,(P=0.0079),AGES組晚期凋亡率實(shí)驗(yàn)組為(18.79±1.09)%,顯著高于對(duì)照組(10.42±0.48)%,(P=0.0197)。AGES組總凋亡率實(shí)驗(yàn)組為(28.68±0.82)%,顯著高于對(duì)照組(11.84±0.465)%,(P=0.0031)。 2.2DMOG組實(shí)驗(yàn)組早期凋亡率為(0.745±0.035)%顯著低于DMOG組對(duì)照組(1.370±0.06)%,(P0.001);DMOG組實(shí)驗(yàn)組晚期凋亡率為(9.45±0.45)%與DMOG組對(duì)照組(10.42±0.48)%比較差異不顯著,(P=0.2783);DMOG組實(shí)驗(yàn)組總凋亡率為(9.845±0.835)%與DMOG組對(duì)照組(11.84±0.465)%相比差異不顯著,(P=0.1728)。 2.3DMOG+AGEs組實(shí)驗(yàn)組早期凋亡率為(1.547±0.029)%比DMOG+AGEs組對(duì)照組(1.267±0.081)%顯著升高,(P=0.0314);DMOG+AGEs組實(shí)驗(yàn)組晚期凋亡率為(11.36±0.44)%比其對(duì)照組(17.37±0.59)%顯著降低,(P=0.0012);DMOG+AGEs組實(shí)驗(yàn)組總凋亡率(12.91±0.415)%與其對(duì)照組(18.64+0.669)%也顯著降低,(P=0.0019)。 2.4HIFsiRNA組實(shí)驗(yàn)組的早期凋亡率為(1.25±0.06)%與其對(duì)照組(0.745±0.035)%相比較沒有太大的變化,(P=0.2929);HIFsiRNA組實(shí)驗(yàn)組晚期凋亡率為(3.75±0.15)%顯著低于其對(duì)照組(10.42±0.48)%,(P=0.0056);HIFsiRNA組實(shí)驗(yàn)組總凋亡率為(4.595±0.495)%顯著低于其對(duì)照組(11.84±0.465)%有,(P=0.0087)。 2.5HIFsiRNA+AGES組實(shí)驗(yàn)組的早期凋亡率為(5.84±0.5)%顯著低于其對(duì)照組(8.155±0.175)%,(P=0.0486)。HIFsiRNA+AGES組實(shí)驗(yàn)組的晚期凋亡率(11.02±0.30)%顯著低于其對(duì)照組(2)(18.55±1.335)%,(P=0.0316)。HIFsiRNA+AGES組實(shí)驗(yàn)組的總凋亡率(16.86±0.19)%顯著低于其對(duì)照組(26.7±1.16)%,(P=0.014)。 3.各組細(xì)胞的蛋白表達(dá) 3.1HIF-1α蛋白的表達(dá) HIF-1α蛋白表達(dá)在AGES組實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的HIF蛋白的相對(duì)表達(dá)量(0.1999±0.02627)比其對(duì)照組(1)(0.3487±0.01257)有顯著性降低,(P=0.0069)。在DMOG組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.4367±0.01449)比其對(duì)照組(5)(0.3487±0.01257)顯著性升高, P=0.0101。HIF-1α蛋白表達(dá)在HIF-1α siRNA組中,實(shí)驗(yàn)組被成功降低了表達(dá),轉(zhuǎn)染效率約70%,敲低表達(dá)約45%。在DMOG+AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.2548±0.01085)比其對(duì)照組(0.1999±0.02627)無(wú)顯著差異,P=0.1253。在HIF-1α siRNA+AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.2011±0.01438)比對(duì)照組(0.1999±0.02627)無(wú)顯著差異, P=0.9697。 3.2Caspase3蛋白的表達(dá) Caspase3蛋白在AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.3410±0.0131)與其對(duì)照組(0.4297±0.0293)比較無(wú)顯著性差異,(P=0.0503)。在DMOG組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.4758±0.0269)與其對(duì)照組(0.4297±0.0293)比較無(wú)顯著性差異, P=0.3109。在HIF-1α siRNA組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.3003±0.02016)比其對(duì)照組(0.6539±0.04475)顯著性降低, P=0.0020。在DMOG+AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.4772±0.0492)與其對(duì)照組(0.5525±0.03144)比較無(wú)顯著性差異,P=0.2665。在HIFsiRNA+AGES組實(shí)驗(yàn)組中的相對(duì)表達(dá)量(0.2855±0.022)低于其對(duì)照組(0.341±0.13),P=0.0948。 3.3HO-1蛋白的表達(dá) HO-1蛋白在AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.2265±0.01211)比其對(duì)照組(0.3852±0.02199)有顯著性降低,(P=0.0032)。在DMOG組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.4223±0.008370)與其對(duì)照組(0.3852±0.02199))相比較沒有顯著性差異,P=0.1907。在HIF-1α siRNA組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.3418±0.02062)與其對(duì)照組(0.3852±0.02199)相比較沒有顯著性差異, P=0.2231。在DMOG+AGES組實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的HO-1基因蛋白的相對(duì)表達(dá)量(0.4638±0.05544)與其對(duì)照組(0.2265±0.01211)相比顯著性升高,P=0.0139。在HIFsiRNA+AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.3086±0.0154)與其對(duì)照組(0.2265±0.01211)相比顯著性升高,P=0.0138。 3.4CYP17A1蛋白的表達(dá) CYP17A1蛋白在AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.7441±0.03956)與其對(duì)照組(0.7462±0.02578)比較無(wú)顯著性差異,(P=0.9664)。在DMOG組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.8273±0。02107)與其對(duì)照組(0.7462±0.02578)比較無(wú)顯著性差異,P=0.0715。在HIF-1α siRNA組實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量(0.5158±0.01579)比其對(duì)照組(0.7462±0.02578)顯著性降低, P=0.0016。在DMOG+AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.7164±0.02530)與其對(duì)照組(0.7441±0.03956)比較無(wú)顯著性差異,P=0.5864。在HIFsiRNA+AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.3547±0.02325)比其對(duì)照組(0.7441±0.03956)有顯著性降低, P=0.0011。 3.5StAR蛋白的表達(dá) StAR蛋白在AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.6734±0.04594)與是對(duì)照組(0.7984±0.03910)相比沒有顯著性差異,(P=0.1069)。在DMOG組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.7951±0.04411)與是對(duì)照組(5)(0.7984±0.03910))相比較沒有顯著性差異, P=0.9578。在HIFsiRNA組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.6420±0.05320)與其對(duì)照組(0.7984±0.03910)相比較沒有顯著性差異, P=0.0769。在DMOG+AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.6291±0.05480)與其對(duì)照組(0.6734±0.04594)相比沒有有顯著性差異,P=0.3437。在HIFsiRNA+AGES組實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)量(0.4163±0.02377)比其對(duì)照組(0.6734±0.04594)顯著性降低, P=0.010。 結(jié)論 (1)HIF-1α可降低ROS的產(chǎn)生,在氧化應(yīng)激引起的男性不育中發(fā)揮了調(diào)控作用; (2)AGES引起的氧化應(yīng)激損傷不影響TM3細(xì)胞中的CYP17A1(P45017α1)和StAR基因的表達(dá),但是可以介導(dǎo)HIF-1α對(duì)CYP17A1和StAR基因表達(dá)的調(diào)控; (3)AGEs可以導(dǎo)致HO-1顯著下降,并介導(dǎo)HIF-1α對(duì)HO-1的調(diào)控。 (4)HIF-1α促進(jìn)Caspase3的表達(dá)升高,從而引起TM3的凋亡。 (5)HIF-1α在氧化應(yīng)激損傷中的對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的調(diào)控作用為男性不育癥的診治提供了思路。
【關(guān)鍵詞】:男性不育癥 睪丸間質(zhì)細(xì)胞 低氧誘導(dǎo)因子(HIF) 氧化應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】:吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2015
【分類號(hào)】:R698.2
【目錄】:
  • 中文摘要4-9
  • Abstract9-16
  • 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照16-18
  • 第1章 前言18-24
  • 1.1 研究背景18
  • 1.2 睪丸間質(zhì)細(xì)胞(TM3) 與氧化應(yīng)激18-19
  • 1.3 HIF-1α的結(jié)構(gòu)及其功能19-20
  • 1.4 HIF 在細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用20-22
  • 1.4.1 HIF-1α與細(xì)胞凋亡20
  • 1.4.2 HIF-1α和氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)20-21
  • 1.4.3 HIF-1α與糖基化終末產(chǎn)物21-22
  • 1.4.4 HIF-1α與脯氨酸羥化酶22
  • 1.5 選題依據(jù)22-24
  • 第2章 材料與方法24-33
  • 2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象24
  • 2.1.1 細(xì)胞株24
  • 2.1.2 細(xì)胞冷凍復(fù)蘇24
  • 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑24-27
  • 2.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器24-25
  • 2.2.2 主要試劑25-26
  • 2.2.3 主要試劑的配制26-27
  • 2.3 實(shí)驗(yàn)方法27-32
  • 2.3.1 實(shí)驗(yàn)分組27-28
  • 2.3.2 細(xì)胞處理28-29
  • 2.3.3 靶向 HIF-1α的 shRNA 干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建29
  • 2.3.4 篩選干擾效率最佳的 siRNA 片段29-30
  • 2.3.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)30
  • 2.3.7 Western blotting 檢測(cè):30-32
  • 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析32-33
  • 第3章 結(jié)果33-54
  • 3.1 HIF 在氧化應(yīng)激中對(duì) TM3 細(xì)胞 ROS 含量的影響33-35
  • 3.1.1 AGES 組 TM3 細(xì)胞 ROS 含量變化33
  • 3.1.2 HIFsiRNA+ AGES 組 TM3 細(xì)胞 ROS 含量變化33
  • 3.1.3 HIFsiRNA 組 TM3 細(xì)胞 ROS 含量變化33
  • 3.1.4 DMOG+ AGES 組 TM3 細(xì)胞 ROS 含量變化33-34
  • 3.1.5 DMOG 組 TM3 細(xì)胞 ROS 含量變化34-35
  • 3.2 HIF 在氧化刺激中對(duì) TM3 細(xì)胞凋亡的影響35-41
  • 3.2.1 AGES 組 TM3 細(xì)胞的凋亡35-37
  • 3.2.2 DMOG 組 TM3 細(xì)胞的凋亡37-38
  • 3.2.3 DMOG+AGEs 組 TM3 細(xì)胞凋亡率的影響38-39
  • 3.2.4 HIFsiRNA 組 TM3 細(xì)胞的凋亡39-40
  • 3.2.5 HIFsiRNA+ AGES 組 TM3 細(xì)胞的凋亡40-41
  • 3.3 HIF 調(diào)控 TM3 細(xì)胞氧化應(yīng)激蛋白表達(dá)的變化41-54
  • 3.3.1 HIF-1α蛋白表達(dá)41-44
  • 3.3.2 HIF-1α對(duì) TM3 細(xì)胞 Caspase 3 蛋白的調(diào)控44-46
  • 3.3.3 HIF-1α對(duì) TM3 細(xì)胞 HO-1 蛋白的調(diào)控46-48
  • 3.3.4 HIF-1α對(duì) TM3 細(xì)胞 CYP17A1 蛋白的調(diào)控48-51
  • 3.3.5 HIF-1α對(duì) TM3 細(xì)胞 StAR 蛋白的調(diào)控51-54
  • 第4章 討論54-57
  • 第5章 結(jié)論57-58
  • 參考文獻(xiàn)58-63
  • 作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間所取得的科研成果63-64
  • 致謝64

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 戚亞偉;胡傳銀;陳紹紅;趙云濤;劉鈾;;非酶糖基化終末產(chǎn)物抑制大鼠睪丸Leydig細(xì)胞睪酮的生成[J];中華男科學(xué)雜志;2014年05期

2 ;Differential and Reciprocal Regulation between Hypoxia-inducible Factor-αSubunits and Their Prolyl Hydroxylases in Pulmonary Arteries of Rat with Hypoxia-induced Hypertension[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2006年06期

3 孫應(yīng)彪;陳建華;趙健雄;朱玉真;;扶正解毒顆粒對(duì)硫酸鎳致大鼠睪丸生殖細(xì)胞損傷的拮抗作用[J];毒理學(xué)雜志;2007年04期


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本文編號(hào):475548

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